一种刺激隐核虫亚单位疫苗的制备方法及其应用技术

本申请涉及一种刺激隐核虫亚单位疫苗的制备方法及其应用。刺激隐核虫全虫疫苗的批文申请和产业化遇到巨大挑战，主要因为该寄生虫无法进行离体培养，必须在鱼体上才能进行繁殖，因而难以获得足够的虫体用以生产疫苗，更为重要的是难以制订规范的生产流程和质量标准，这迫使我们向更深层次进行研究，开发基因工程疫苗。本发明专利技术从刺激隐核虫转录组数据库中筛选出表面蛋白C1候选基因，并在四膜虫上表达出重组蛋白制备疫苗用以免疫海水鱼，通过检测疫苗的免疫原性和保护性，筛选到刺激隐核虫有效的保护性抗原基因。

Preparation method and application of a subunit vaccine for stimulating Cryptococcus

The present invention relates to a preparation method and its application for stimulating the subunit vaccine of cryptococcus. Cryptocaryonirritans parasite vaccine approval application and industrialization encountered great challenges, mainly because the parasite cannot be cultured in vitro, must be in order to fish breeding, so it is difficult to obtain enough body to produce vaccines, more important is to develop the production process and quality standard, which forced we have to deeper research, the development of genetic engineering vaccine. The present invention screened surface protein C1 candidate gene from cryptocaryonirritans transcriptome database, and express the recombinant protein preparation for immune vaccine in four marine fish Tetrahymena, through the detection of vaccine immunogenicity and protection, protection of the original resistance gene screening to c.irritans effective.

【技术实现步骤摘要】
一种刺激隐核虫亚单位疫苗的制备方法及其应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种刺激隐核虫亚单位疫苗的制备方法及其应用。
技术介绍
刺激隐核虫(Cryptocaryonirritans)是一种寄生于海水鱼类的纤毛虫，引起海水养殖鱼类严重致死性疾病——白点病。近年来，由于我国海水养殖的超负荷发展，养殖环境的恶化，刺激隐核虫病已经成为大范围、经常性爆发的烈性传染病，给海水渔业造成了非常严重的危害。由于海水养殖的开放性特征，很难杜绝刺激隐核虫对鱼体的感染，加之尚无有效的治疗药物和处理方法，使得该病的防治异常困难。目前生产上主要采用药物防治和物理防治(ColorniandBurgess，1997；蔡泽平等，2001；Noritakaetal.，2001；Noritakaetal.，2003；黄玮等，2004)，然而这些方法由于存诸多缺陷，如效果不稳定、破坏养殖环境、危害食品安全、实施不便等，很难达到理想的效果。大量的研究证实，海水鱼类对刺激隐核虫感染会产生获得性免疫保护，疫苗接种可能成为防治刺激隐核虫病的有效方法(Yoshinagaetal，1997；Yambotetal，2006；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种刺激隐核虫亚单位疫苗的制备方法及其应用，其特征在于，步骤如下：一、刺激隐核虫传代：将10尾感染刺激隐核虫的卵形鲳鲹置于500L海水中暂养，2天后的晚上转到特制的收虫器，次日早晨收集从鱼体脱落的包囊；包囊于灭菌海水中充气培养60小时左右可孵化出大量幼虫，将孵化2小时内的幼虫以20000/尾再次感染卵形鲳鲹，以此建立稳定的刺激隐核虫传代系统。二、斜带石斑鱼的暂养：整个养殖过程中无刺激隐核虫感染记录；实验鱼暂养2周，水温为25℃，每天换水量为50％，感染前每天投喂体重4％的养殖饲料；试验前，随机抽取10尾鱼进行镜检和阻动试验以确认实验鱼无刺激隐核虫及其他体表寄生虫感染。三、刺激隐核虫总RNA的提...

【技术特征摘要】
1.一种刺激隐核虫亚单位疫苗的制备方法及其应用，其特征在于，步骤如下：一、刺激隐核虫传代：将10尾感染刺激隐核虫的卵形鲳鲹置于500L海水中暂养，2天后的晚上转到特制的收虫器，次日早晨收集从鱼体脱落的包囊；包囊于灭菌海水中充气培养60小时左右可孵化出大量幼虫，将孵化2小时内的幼虫以20000/尾再次感染卵形鲳鲹，以此建立稳定的刺激隐核虫传代系统。二、斜带石斑鱼的暂养：整个养殖过程中无刺激隐核虫感染记录；实验鱼暂养2周，水温为25℃，每天换水量为50％，感染前每天投喂体重4％的养殖饲料；试验前，随机抽取10尾鱼进行镜检和阻动试验以确认实验鱼无刺激隐核虫及其他体表寄生虫感染。三、刺激隐核虫总RNA的提取；四、一链cDNA的合成：1)按以下体系添加试剂：TotalRNA，1μg；DNaseIbuffer，1μl；DNaseI，1μl；最后加RNasefreewater至10μl，混匀，短暂离心，37℃恒温孵育30min，以去除基因组DNA污染；2)反应结束后向上述体系中加入1μl25mM的EDTA，振荡混匀后，65℃恒温孵育10min，以灭活DNaseI；3)将反应产物迅速转移至冰上冷却；4)cDNA合成：反应试剂配制体系如下：第一步变性的RNA溶液，11μl；10pmol/μl的Oligo(dT)20，1μl；5×RTBuffer，4μl；dNTPMixture(各10mM)，2μl；10U/μl的RNaseInhibitor，1μl；ReverTraAce，1μl；TotalVolume20μl；反应程序：42℃，30min；99℃，5min；4℃，5min；反应产物转到-20℃保存备用。五、表面蛋白C1基因开放阅读框(ORF)的克隆：结合刺激隐核虫转录组数据的全长序列，分别设计了用于扩增刺激隐核虫表面蛋白C1基因ORF的引物(5’到3’)：C1F，ATGTAAAAGATTTTAGCTATTTTATT；C1R，TCATTTGAATAAAAGAGCAAAG；模板使用刺激隐核虫一链cDNA，引物使用C1F/R，PCR反应体系如下：一链cDNA，2μl；10μM的C1F，2μl；10μM的C1R，2μl；PrimeSTARMAXmix，25μl；加H2O至50μl；PCR反应程序为：98℃，10s；58℃，15s；72℃，2min，35个循环，最后72℃延伸10min；用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；回收目的条带，产物与克隆载体pEASY-BluntCloningVector进行连接，连接反应体系如下：PCR回收产物，4μl；pEASY-BluntCloningVector，1μl；混匀后，于25℃连接30min后转化感受态细胞，从-80℃取出Trans1-T1感受态细胞50μl置于冰上，待感受态细胞刚化开时加入上述所有连接产物，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激30s，立即置于冰上2min，加入1mLLB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养1h，取100μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：但学明，李言伟，莫泽权，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44