一种重组白细胞介素18及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组白细胞介素18及其制备方法与应用。本发明专利技术提供的rhIL‑18在其N端第10位由丝氨酸突变为可羟基化的氨基酸残基，以如SEQ ID NO:1所示的hrIL‑18进行实验，其解决了野生型IL‑18溶解度低、稳定性差、生物活性低等缺点，而且如SEQ ID NO:1所示的hrIL‑18更易纯化，适合工业化生产。本发明专利技术提供的rhIL‑18能够抑制人内皮细胞微管的产生，且能够促进NK细胞的活性、促进IFN‑γ的形成；而对于人视网膜色素上皮细胞的活性不会产生影响，说明该rhIL‑18能够作为治疗眼底新生血管性疾病和/或恶性肿瘤的药物。

【技术实现步骤摘要】
一种重组白细胞介素18及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种重组白细胞介素18及其制备方法与应用。
技术介绍
黄斑区视网膜后有异常的新生血管生长称为湿性老年性黄斑变性(AMD)；糖尿病性微血管病变中的特异性眼底病变，例如视网膜新生血管，称为糖尿病视网膜病变(DR)。2013年全球糖尿病视网膜病变(DR)患者9300万，其中增殖性DR(PDR)患者1700万，糖尿病性黄斑水肿患者2100万，威胁视力的DR患者2800万。糖尿病发病5年后糖尿病视网膜病变发生率为25％，10年后增至60％，15年后可高达75％～80％。如此可见，加快研制新型治疗眼底血管病变制剂，不仅具有社会效益，而且将会产生巨大的经济效益。目前，对于AMD或DR缺乏理想的治疗措施，临床上主要采用对症治疗或辅助性治疗方法来控制或延缓疾病的发展，常用的治疗方法如下：降糖药物、抗炎药物、局部使用TNF-α拮抗剂、菲诺贝特、血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂、RAS系统抑制剂、非酶糖基化抑制剂、综合疗法和激光治疗。抗-VEGF治疗涉及到定期眼内注射抗-VEGF单抗(如Lucentis),不仅具有一定的伤害性，而且价格昂贵且只针对确诊病例，此外，尽管发生率很低，但每次注射均会带来眼内感染、视网膜出血和剥离的严重风险，而且这个治疗没有终点。1995年IL-18作为IFNγ诱导因子被报道，随后证明给小鼠全身注射IL-18(50μg/kg)6天，对FGF诱导的角膜毛细血管生成具有抑制作用。也有报道表明IL-18对氧诱导的小鼠视网膜病变模型的视网膜病理性新生血管的生成具有调控作用。Doyle等最近报道，眼内或全身注射鼠源性的IL-18(SB-528775)可以防止实验诱导的CNV。因此IL-18的单独使用或为了降低抗新生血管药物眼内注射频率而与其合用都是可行的。此外该作者还证明鼠源性和人源性的重组IL-18对视网膜色素上皮细胞(RPE)都是非常安全的，RPE细胞是AMD中功能异常的关键细胞。ShenJ.等证明房水中IL-18含量高的患者在接受Lucentis单抗治疗黄斑水肿及视网膜静脉栓塞时将显著改善视觉效果，他们同时证明VEGF以相互抑制的方式调控IL-18含量，并用多个视网膜/CNV模型证明重组IL-18能够调节病理模型的眼底渗出，他们提出IL-18可能成为调控眼睛病理性新生血管生成的新方法，这一结果与上述Doyle等报道一致。2006年重组人IL-18(商品名：Iboktadekin)作为抗肿瘤制剂进入临床试验阶段，由GlaxoSmithKline公司研发。已有多篇文章报道了IL-18人体试验是安全的，而且未见有关眼部副作用的报道。此外，已经报道给啮齿类全身注射IL-18，在视网膜可检出较高含量的IL-18，这一结果提示IL-18在视网膜中的生物可用性。病人使用IL-18可能引起1～2级的短暂发热，但能快速缓解。用高达2000μg/kg剂量，病人的眼部也没出现明显副作用。综上所述重组IL-18在眼科学中的研究结果表明IL-18对眼部病理性新生血管性疾病可能具有应用价值。既然目前已证明IL-18临床试验试是安全的，那么IL-18就可用于CNV和湿性AMD的辅助治疗研究，它能否成为有效的药物，值得进一步深入研究。目前，重组人IL-18的制备主要采用生物工程的方式，但由于IL-18序列的结构的特殊性，其在生物合成的过程中不易纯化，且合成后活性很低。因此，纯度低、复性率低和产量低等一些问题，导致了IL-18的制备成本增高，进而导致价格昂贵。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种重组白细胞介素18及其制备方法与应用。本专利技术提供的重组白细胞介素18具有较高的生物活性。本专利技术提供了重组人白细胞介素18，其N端第10位由丝氨酸突变为可羟基化的氨基酸残基。本专利技术实施例中，重组白细胞介素18的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术提供的重组白细胞介素18为重组人白细胞介素18，记为rhIL-18。其在野生型人IL-18的基础上，将第10位氨基酸有丝氨酸(Ser)突变为可羟基化的氨基酸残基。所述可羟基化的氨基酸残基包括Pro或Lys，翻译后蛋白质中的Pro发生羟基化，可提高蛋白质的溶解度，增加蛋白质的稳定性。本专利技术实施例中，将第10位氨基酸的丝氨酸(Ser)突变为脯胺酸(Pro)(如SEQIDNO:1所示)。经实验表明，如SEQIDNO:1所示的hrIL-18解决了野生型IL-18溶解度低、稳定性差、生物活性低等缺点，而且如SEQIDNO:1所示的hrIL-18更易纯化，适合工业化生产，所制备的hrIL-18样品对新生血管的生成具有较强的抑制作用。本专利技术还提供了编码本专利技术所述重组白细胞介素18的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本专利技术所述的hrIL-18的核苷酸序列。一些实施例中，编码本专利技术重组白细胞介素18的DNA分子的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术提供的编码hrIL-18的DNA分子可采用人工合成的方式获得，也可通过体外扩增的方法获得。本专利技术采用体外扩增的方式获得。作为优选，采用含有突变氨基酸对应密码子的引物对，以人体细胞mRNA为模板进行RT-PCR，从而获得编码hrIL-18的核苷酸序列。所述含有突变氨基酸对应密码子的引物对序列如SEQIDNO:3～4所示。所述人体细胞为：外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、扁桃体细胞、肝细胞、脾细胞、胸腺细胞、骨髓细胞和/或肾细胞。本专利技术还提供了SEQIDNO:3所示上游引物和SEQIDNO:4所示下游引物组成的引物对。本专利技术提供了一种表达载体，其包括骨架和编码本专利技术所述重组白细胞介素18的DNA分子。一些实施例中，编码本专利技术重组白细胞介素18的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。一些实施例中，骨架为pBV220质粒。本专利技术所述表达载体的构建方法为，通过PCR在编码本专利技术所述重组白细胞介素18的DNA分子两端添加限制性酶切位点，然后对所获得片段进行酶切后，与经酶切的骨架进行连接。一些实施例中，表达载体中，SEQIDNO:2所示核苷酸序列的插入位点为EcoRⅠ和BamHⅠ。本专利技术还提供了转染或转化本专利技术所述表达载体的宿主细胞。一些实施例中，宿主细胞为大肠杆菌。一些实施例中，宿主细胞为大肠杆菌DH5α。本专利技术实施例中，宿主细胞由本专利技术提供的表达载体转化大肠杆菌获得。本专利技术还提供了一种重组白细胞介素18的制备方法，其为发酵本专利技术所述的宿主细胞。在发酵过程中诱导表达rhIL-18，诱导方式为温度诱导。每升发酵的培养基中包括：所述诱导表达启动时菌液浓度为OD600为2.0；调节诱导表达的温度为42℃，时间为4h，氨水调节pH值为7.0，启动表达。以本专利技术提供的方法能够在短时间内迅速获得大量的rhIL-18，但其以包涵体形式存在。故而在发酵诱导表达后，还需经过复性和纯化。作为优选，所述发酵后还包括复性和纯化的步骤。所述纯化包括：破碎发酵后的宿主细胞，收集沉淀；以包涵体洗涤液洗涤沉淀后，加入包涵体溶解液，4℃搅拌4h以上，离心、收集上清液；所述上清液与复性液混合，室温搅拌4h后，4℃复性20h以上，所得溶液上样至经平衡的羟基磷灰石层析柱，流速为10ml/min；用平本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组人白细胞介素18，其特征在于，其N端第10位由丝氨酸突变为可羟基化的氨基酸残基。

【技术特征摘要】
1.重组人白细胞介素18，其特征在于，其N端第10位由丝氨酸突变为可羟基化的氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的重组人白细胞介素18，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。3.编码权利要求1或2所述重组白细胞介素18的DNA分子。4.编码如SEQIDNO:1所示氨基酸序列的重组白细胞介素18的DNA分子，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。5.SEQIDNO:3所示上游引物和SEQIDNO:4所示下游引物组成的引物对。6.一种表达载体，其特征在于，包括骨架和权利要求3或4所述的DNA分子。7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述骨架为pBV220质粒。8.转染或转化权利要求6或7所述表达载体的宿主细胞。9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。10.权利要求1或2所述重组白细胞介素18...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵洪礼，王卓实，周艳楠，刘畅，张鹏，何伟，
申请(专利权)人：何伟，
类型：发明
国别省市：辽宁,21