一种薄层色谱联合高效液相色谱检测动物饲料中氯霉素含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种薄层色谱联合高效液相色谱检测动物饲料中氯霉素含量的方法，属于食品安全风险监测领域。本发明专利技术方法包括如下步骤：动物饲料经乙酸乙酯提取，乙睛饱和正己烷脱脂，以体积比二氯甲烷:丙酮:氨水（25%‑28%）等于（1‑5）:（5‑9）:（0.05‑0.25）的混合液作为展开液采用薄层色谱分离样品，再采用高效液相色谱进行检测。本发明专利技术显著提高了对动物饲料中其他物质的抗干扰能力，同时降低了检测成本，减少了有机溶剂的用量，定量分析结果可靠，适用于基层检测单位对饲料中的氯霉素进行日常监控。

【技术实现步骤摘要】
一种薄层色谱联合高效液相色谱检测动物饲料中氯霉素含量的方法
本专利技术涉及食品安全风险监测领域，具体涉及一种薄层色谱联合高效液相色谱检测动物饲料中氯霉素含量的方法。
技术介绍
氯霉素为酰胺醇类抗菌药物，其具有抗菌谱广、抗菌效果好等优点，广泛用于畜禽呼吸道疾病的治疗。混饲给药是氯霉素在兽医临床上常见用法。毒理学研究表明，氯霉素对造血液系统具有明显的毒性，可引起再生障碍性贫血，因而已被我国禁止使用。然而在实际生产中，出于经济利益的驱使，在饲料中违规添加氯霉素的情况时有发生。非法添加氯霉素可能导致其残留于动物源性食品中，危害消费者健康和养殖业的可持续发展。为防止氯霉素的滥用，建立可靠且适合基层检测机构的定量分析方法很有必要。采用酶联免疫分析技术、高效液相色谱和液相色谱-质谱联用技术检测动物饲料中氯霉素的定量分析方法已有文献报道。其中，高效液相色谱法具有检测结果可靠和检测成本低的优点，尤其适合基层检测单位。尽管如此，现有的高效液相色谱法缺乏有效的样品净化步骤，且样品前处理过程过于繁琐，有必要进行改良。例如《光谱实验室》2006年公开的《饲料中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素含量的HPLC测定方法》在样品前处理环节采用乙酸乙酯、水、正己烷反复萃取饲料中的氯霉素，样品前处理过于繁琐，且上述液-液萃取方法无法有效去除饲料中共存的氨基酸、色素等杂质，可能干扰随后的色谱分析。又如《AnalyticaChimicaActa》杂志2008年公开的《Determinationofoxytetracycline,tetracyclineandchloramphenicolantibioticsinanimalfeedsusingsubcriticalwaterextractionandhighperformanceliquidchromatography》采用亚临界水萃取结合固相萃取技术处理饲料样品，需要特殊的仪器设备，且检测成本较高，不利于向基层检测机构推广。薄层色谱是一种经典的样品分离技术。与食品安全分析中常用的固相萃取技术相比，薄层色谱具有分离效果好，成本低廉，绿色环保的优点，非常适合用于生物样品和动物饲料等复杂基质中痕量化合物的分离纯化。李春香在《新型分离技术和高效液相色谱联合测定食品中苏丹红新方法的研究》一文中采用了薄层色谱净化复杂生物样品基质；吴文达等也将薄层色谱和高效液相色谱技术联合，用于检测饲料中玉米赤霉烯酮。尽管如此，将薄层色谱用于动物饲料中氯霉素的分析，这在国内外尚无文献报道。薄层展开条件是薄层色谱分析的关键技术。薄层展开条件取决于目标化合物自身的理化性质和样品基质的特点。药物制剂和化妆品中氯霉素的薄层分析已有文献报道。如莫金娜等在《薄层色谱法检测化妆品中的氯霉素》一文中采用三氯甲烷-甲醇(85:15)的混合溶液作为展开条件；邢丽等在《薄层色谱法鉴别雌氯乳膏中氯霉素和己烯雌酚》中采用二氯甲烷-乙醚-甲醇-氨水(38:5:3:1)分离氯霉素和己烯雌酚；张志芬等在《TLC-UV法测定氯霉素注射液的含量》一文中提到了甲醇-乙醇(9:1)的展开条件；王刚林等在《氯霉素有关物质测定方法的建立》中使用氯仿-甲醇-水(80:20:5)作为展开条件。由于动物饲料组成远比化妆品和药物制剂复杂，上述展开条件并不一定能将饲料中内源性干扰物质和氯霉素分离开。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种可靠、简便、快速的薄层色谱联合高效液相色谱检测动物饲料中氯霉素含量的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种薄层色谱联合高效液相色谱检测动物饲料中氯霉素含量的方法，包括以下步骤：(1)在研磨后的动物饲料中加入乙酸乙酯，涡旋后离心。(2)移取上清液，空气流吹干，先加入乙睛、涡旋，再加入乙睛饱和的正己烷、涡旋，离心，弃去上层正己烷。其中，上清液、乙睛、乙睛饱和的正己烷的体积比为(1-5):(0.05-0.1):(1-5)。(3)将下层的乙腈层(饲料提取液)和氯霉素标准品分别点样于同一块GF-254硅胶薄层板的不同位置，于体积比二氯甲烷:丙酮:氨水等于(1-5):(5-9):(0.05-0.25)的混合液中展开至顶端。所述的氨水的浓度优选为25％-28％。(4)将GF-254硅胶薄层板取出，待溶剂挥干后于254-360nm下检视，根据氯霉素标准品的展开距离标记饲料提取液中氯霉素的大致位置，刮取对应位置的硅胶。(5)于刮取的硅胶中加入乙腈-水混合溶液，涡旋，离心，取上清，通过滤膜过滤。其中，乙腈-水混合溶液中乙腈与水的体积比为30:70-70:30。(6)将过滤后的样品通过高效液相色谱检测氯霉素含量。其中，高效液相色谱流动相为乙腈与水按体积比为30:70-70:30组成的混合液。优选的，步骤(1)中：动物饲料与乙酸乙酯的质量体积比为2-5g:20-100mL；研磨后的动物饲料的粒径为1-10mm；涡旋的时间为1-5min，离心的条件为3000-8000g离心2-5min。优选的，步骤(2)中：空气流吹干的温度为45-60℃；两次涡旋的时间均为1-2min；离心的条件为3000-8000g离心2-5min。优选的，步骤(5)中：涡旋的时间为1-3min；离心的条件为3000-8000g离心5-10min，滤膜为0.22μm有机滤膜。优选的，步骤(6)中高效液相色谱的条件为：色谱分离在WatersSymmetryC18色谱柱(250mm×4.6mmI.D，5μm)内完成，柱温为32-40℃，流动相流速为0.5-1mL/min，检测波长为250-280nm。更优选的，所述的薄层色谱联合高效液相色谱检测动物饲料中氯霉素含量的方法，包括以下步骤：(1)动物饲料经过研磨，过1-10mm筛；称取研磨、过筛的动物饲料样品2-5g，加入乙酸乙酯20-100mL，涡旋1-5min，3000-8000g离心2-5min。(2)移取上清液1-5mL，45-60℃空气流吹干；加入乙睛50-100μL，涡旋1-2min；加入乙睛饱和的正己烷1-5mL，涡旋1-2min，3000-8000g离心2-5min，弃去上层正己烷。(3)将下层乙睛层(饲料提取液)和氯霉素标准品点样于GF-254硅胶薄层板(10cm×10cm)的不同位置，于体积比二氯甲烷:丙酮:氨水(25％-28％)等于(1-5):(5-9):(0.05-0.25)的混合液中展开至顶端。(4)将GF-254硅胶薄层板取出，待溶剂挥干后于254-360nm下检视，根据氯霉素标准品的展开距离标记饲料提取液中氯霉素的大致位置，刮取对应位置的硅胶。(5)于刮取的硅胶中加入体积比乙睛:水等于30:70-70:30的混合液1-2mL，涡旋1-3min，3000-8000g离心5-10min，取上清，用0.22μm有机滤膜过滤。(6)过滤后的样品通过高效液相色谱检测氯霉素含量。一种薄层色谱分离动物饲料中氯霉素的方法，包括上述方法的步骤(1)-(4)。上述方法中，动物饲料中的氯霉素采用标准曲线进行定量，具体为：称取含适量氯霉素的标准品加到10mL容量瓶中，用乙睛溶解、定容、摇匀，过0.22μm有机滤膜，备供试标品溶液用；其中“适量”氯霉素是指5-20mg。取供试标品，以流动相逐级稀释成系列浓度，每本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种薄层色谱联合高效液相色谱检测动物饲料中氯霉素含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）在研磨后的动物饲料中加入乙酸乙酯，涡旋后离心；（2）移取上清液，空气流吹干，先加入乙睛、涡旋，再加入乙睛饱和的正己烷、涡旋，离心，弃去上层正己烷；其中，上清液、乙睛、乙睛饱和的正己烷的体积比为（1‑5）:（0.05‑0.1）:（1‑5）；（3）将下层的乙腈层和氯霉素标准品分别点样于同一块GF‑254硅胶薄层板的不同位置，于体积比二氯甲烷:丙酮:氨水等于（1‑5）:（5‑9）:（0.05‑0.25）的混合液中展开至顶端；（4）将GF‑254硅胶薄层板取出，待溶剂挥干后于254‑360nm下检视，根据氯霉素标准品的展开距离标记饲料提取液中氯霉素的大致位置，刮取对应位置的硅胶；（5）于刮取的硅胶中加入乙腈‑水混合溶液，涡旋，离心，取上清，通过滤膜过滤；其中，乙腈‑水混合溶液中乙腈与水的体积比为30:70‑70:30；（6）将过滤后的样品通过高效液相色谱检测氯霉素含量；其中，高效液相色谱流动相为乙腈与水按体积比为30:70‑70:30组成的混合液。

【技术特征摘要】
1.一种薄层色谱联合高效液相色谱检测动物饲料中氯霉素含量的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）在研磨后的动物饲料中加入乙酸乙酯，涡旋后离心；（2）移取上清液，空气流吹干，先加入乙睛、涡旋，再加入乙睛饱和的正己烷、涡旋，离心，弃去上层正己烷；其中，上清液、乙睛、乙睛饱和的正己烷的体积比为（1-5）:（0.05-0.1）:（1-5）；（3）将下层的乙腈层和氯霉素标准品分别点样于同一块GF-254硅胶薄层板的不同位置，于体积比二氯甲烷:丙酮:氨水等于（1-5）:（5-9）:（0.05-0.25）的混合液中展开至顶端；（4）将GF-254硅胶薄层板取出，待溶剂挥干后于254-360nm下检视，根据氯霉素标准品的展开距离标记饲料提取液中氯霉素的大致位置，刮取对应位置的硅胶；（5）于刮取的硅胶中加入乙腈-水混合溶液，涡旋，离心，取上清，通过滤膜过滤；其中，乙腈-水混合溶液中乙腈与水的体积比为30:70-70:30；（6）将过滤后的样品通过高效液相色谱检测氯霉素含量；其中，高效液相色谱流动相为乙腈与水按体积比为30:70-70:30组成的混合液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中：动物饲料与乙酸乙酯的质量体积比为2-5g:20-100mL。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中：研磨后的动物饲料的粒径为1-10mm；涡旋的时间为1-5min，离心的条件为3000-8000g离心2-5min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中：空气流吹干的温度为45-60℃；两次涡旋的时间均为1-2min；离心的条件为3000-8000g离心2-5min。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的氨水的浓度为25%...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨波，杨金晶，孙桂芝，
申请(专利权)人：武汉生物工程学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42