批量获得高精度昆虫COI基因条形码的方法和试剂盒技术

本申请公开了一种批量获得高精度昆虫COI基因条形码的方法和试剂盒。本申请方法，将96对index序列分别添加到COI基因标准引物5’端，形成新的带index序列的COI基因标准引物，采用该引物分别对待测昆虫DNA进行PCR扩增；将PCR产物混合，进行Illumina建库，采用可以PE150测序的NGS平台测序；对测序数据进行信息分析，获得完整的COI基因条形码序列。本申请充分利用高通量测序优点，大大提高COI基因条形码的获取效率、降低了时间和人工成本；可获得全长COI基因条形码序列，与桑格测序结果达99.98％一致性，对桑格测序的简并碱基也可区分出不同单倍型，为生物多样性研究提供了有利工具。

【技术实现步骤摘要】
批量获得高精度昆虫COI基因条形码的方法和试剂盒
本申请涉及基因条形码获取领域，特别是涉及一种批量获得高精度昆虫COI基因条形码的方法和试剂盒。
技术介绍
在过去的几年里，科学家在构建精心选择的DNA标记方面做出了巨大努力。例如，生命的国际条形码(iBOL，www.ibol.org)项目在通过很多年的积累之后，已经得到了覆盖约20万种的4,694,277条序列。其中，包括细胞色素氧化酶C亚基I(缩写COI)作为动物的条形码标记，核内转录间隔区(缩写ITS)作为真菌的条形码标记，rbcL基因和基因matK基因为植物的条形码。DNA条形码已被证明能够加快未知物种的发现和识别，推进全面的生物调查或“所有类群生物多样性资源”(ATBI)项目，也适用于法医学应用和环境管理等。目前，大部分基因条形码的获取都是通过单样本的DNA提取、PCR扩增，然后进行Sanger测序或双二碱基-index的Illumina测序。其中，Sanger测序在一定程度上具有比较高的准确性；但是通量很低、费时费力，并且，中间还需要电泳跑胶等步骤。Sanger测序的峰图在DNA质量不好或PCR扩增效率低的情况下会出现杂峰，影响最终获得的条形码的准确性。此外，对于微量DNA样本和非模式类群的物种，采用Sanger测序法获得条形码，一般都要经过多轮的PCR才能满足测序的要求。另外通过Sanger测序一般不会得到研究物种中包含的微生物或寄生虫的共扩增，例如沃尔巴克氏体感染、肠道微生物等的序列信息，而这些信息在研究中往往非常有价值。Shokrallaetal.于2015年进行了双二碱基-index方法利用IlluminaMiseqHTS平台对DNA条形码进行测序，结果显示在1010个样本的COI基因DNA条形码的658bp的测序成功率为97.3％，相对于传统的Sanger测序，每个样品的成本和劳动时间减少了近80％。简要地说，该技术采用了两次PCR反应，每次使用两种不同的引物，其中一次PCR扩增的是条形码的5’端区域，另一次PCR扩增的是条形码3’端区域，两次PCR扩增产生两个较小的重叠片段，约82个碱基对重叠，从而克服Illumina测序平台的读长的限制。但是，即便如此，Illumina测序的最长测序能力是300PE，两次PCR扩增重叠组装后也只能达到约518bp的长度，与COI基因条形码的658bp仍然有至少100bp的gap，所以并不能通过一次测序获得COI基因条形码区域的全长，这大大影响了数据的完整性，不能满足通过COI基因条形码进行物种鉴定的使用需求。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种新的批量获得高精度昆虫COI基因条形码的方法和试剂盒。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种批量获得高精度昆虫COI基因条形码的方法，包括将96对index序列分别添加到COI基因的标准引物的5’端，形成新的带有index序列的96对COI基因标准引物；采用带有index序列的COI基因标准引物，分别对待测昆虫的DNA样本进行单重PCR扩增；将PCR扩增产物混合，进行Illumina建库，采用可以进行PE150测序的NGS平台对所构建的文库进行测序；最后，通过对测序数据进行信息分析，获得完整的COI基因条形码序列。其中，96对index序列是自行设计的序列，符合一般测序平台对index序列的需求。需要说明的是，本申请的昆虫COI基因条形码获得方法，实际上就是基于高通量的NGS平台对昆虫COI基因进行测序，相比于传统的Sanger测序方法，本申请的昆虫COI基因条形码获得方法效率更高，并且，降低了时间和人工成本，解决了低质量DNA不能进行测序的问题，同时也能挖掘到Sanger测序不能获得的嵌合体和共生微生物或寄生虫的序列情况。相比现在Illumina测序方法，本申请通过可以进行PE150测序的NGS平台和测序数据的信息分析，可以获得全长的COI基因条形码序列，并且与桑格的一致性几乎达到了100％，甚至同一物种的不同单倍型也可以组装出来。本申请的批量获得高精度昆虫COI基因条形码的方法，为研究生物多样性提供了有利工具。优选的，信息分析包括数据过滤、序列拆分和两端连接、间隙填充；数据过滤包括，a)去除接头污染序列，b)去除包含N数目大于10的序列，c)去除低质量reads；序列拆分和两端连接包括，结合index序列和COI基因标准引物序列，对所有reads序列进行拆分，对于每个待测昆虫个体，将其在拆分中得到的5’末端和3’末端序列按照98％的相似度聚类，选择聚类结果中最高丰度的序列进行下游的连接和组装，获得COI基因条形码的全长序列；选择聚类结果中丰度不小于所述最高丰度的1/10的序列，按照其测序序列的ID信息把有成对关系的序列挑选出来，将重叠区具有高于95％的相似性的且重叠长度达到30-120bp的序列用COAP连接，最后，将两端覆盖度不足5的碱基截断，排列出双端序列有可能的组合，获得在样本中潜在的微生物或寄生虫的共扩增序列；间隙填充包括，采用SOAPBarcode算法对获得的COI基因条形码全长序列进行补充，获得高精度的完整的昆虫COI基因条形码；具体的，将5’端定义为起始点，并且3’末端作为终点，对于每个待测昆虫个体，用kmer构建debrujin图形，从起点到终点的步骤查找潜在的连接路径，采用以下三种策略确保路径的正确性，a)删除在分叉处前的kmer的丰度小于kmer平均丰度的10％的路径；b)普通读不同出度和位于最后分叉之前kmer之间进行计数，删除有一个以上的出程度第一步之后剩余，并且出度共同的reads小于平均丰度的10％的路径，c)删除扩大超出了预先设定的长度没有终点的路径。其中，测序序列的ID信息，是FASTQ文件格式中第一行文件，对应测序仪运行信息。成对关系的序列是指，可以进行PE150测序的NGS平台中，采用的是PE测序，即pari-end双末端测序，所以对于一个双链的DNA片段，从两端测，就有一对reads。出度是图论中的术语，对有向图而言，顶点的度可分为出度和入度。一个顶点的出度为d，是指有d条边以该顶点为起点，或说与该点关联的出边共有d条。入度的概念也类似。需要说明的是，本申请的批量获得高精度昆虫COI基因条形码的方法，通过本申请特殊的信息分析，能够获得更加准确的高精度的完整昆虫COI基因条形码序列，为后续的基于条形码的检测和研究奠定了坚实的基础。优选的，Illumina建库的插入片段设计为250bp，NGS平台的测序长度为150PE。本申请的一种实现方式中，具体的可以进行PE150测序的NGS平台为Hiseq测序平台。需要说明的是，虽然本申请的测序长度为150PE，但是，建库片段为250bp；因此，在150PE的测序长度下可以准确的测定插入片段；并且，通过对测序数据进行信息分析，可以获得完整的658bp的COI基因条形码区域全长。优选的，标准引物的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，下游引物为SeqIDNo.2所示序列；SeqIDNo.1：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’SeqIDNo.2：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’。需要说明的是，本申请的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种批量获得高精度昆虫COI基因条形码的方法，其特征在于：包括将96对index序列分别添加到COI基因的标准引物的5’端，形成新的带有index序列的96对COI基因标准引物；采用带有index序列的COI基因标准引物，分别对待测昆虫的DNA样本进行单重PCR扩增；将PCR扩增产物混合，进行Illumina建库，采用可以进行PE150测序的NGS平台对所构建的文库进行测序；最后，通过对测序数据进行信息分析，获得完整的COI基因条形码序列。

【技术特征摘要】
1.一种批量获得高精度昆虫COI基因条形码的方法，其特征在于：包括将96对index序列分别添加到COI基因的标准引物的5’端，形成新的带有index序列的96对COI基因标准引物；采用带有index序列的COI基因标准引物，分别对待测昆虫的DNA样本进行单重PCR扩增；将PCR扩增产物混合，进行Illumina建库，采用可以进行PE150测序的NGS平台对所构建的文库进行测序；最后，通过对测序数据进行信息分析，获得完整的COI基因条形码序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述信息分析包括数据过滤、序列拆分和两端连接、间隙填充；所述数据过滤包括，a)去除接头污染序列，b)去除包含N数目大于10的序列，c)去除低质量reads；所述序列拆分和两端连接包括，结合index序列和COI基因标准引物序列，对所有reads序列进行拆分，对于每个待测昆虫个体，将其在拆分中得到的5’末端和3’末端序列按照98％的相似度聚类，选择聚类结果中最高丰度的序列进行下游的连接和组装，获得COI基因条形码的全长序列；选择聚类结果中丰度不小于所述最高丰度的1/10的序列，按照其测序序列的ID信息把有成对关系的序列挑选出来，将重叠区具有高于95％的相似性的且重叠长度达到30-120bp的序列用COAP连接，最后，将两端覆盖度不足5的碱基截断，排列出双端序列有可能的组合，获得在样本中潜在的微生物或寄生虫的共扩增序列；所述间隙填充包括，采用SOAPBarcode算法对获得的COI基因条形码全长序列进行补充，获得高精度的完整的昆虫COI基因条形码；具体的，将5’端定义为起始点，并且3’末端作为终点，对于每个待测昆...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘山林，杨琛涛，周程冉，周欣，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44