一种抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法技术

本发明专利技术公开一种抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法，包括以下步骤：PEDV感染发病仔猪和抗病仔猪的筛选及其肠道内容物样品的采集；PEDV感染发病仔猪和抗病仔猪肠道微生物菌群的高通量测序；PEDV感染发病仔猪和抗病仔猪肠道微生物宏基因组学对比分析；以及抗PEDV感染的益生菌的筛选及鉴定。本发明专利技术提出的抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法，有针对性地从抗病仔猪道庞大的微生物菌群中筛选出具有抗流行性腹泻功能的益生菌，针对性强，避免了筛选的盲目性，提高了筛选效率，节省了大量的人力、物力及时间。

A screening method for feeding probiotics for anti piglet epidemic diarrhea

【技术实现步骤摘要】
一种抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法
本专利技术涉及仔猪饲料添加剂
，特别涉及一种抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法。
技术介绍
益生菌在保障人畜健康或防治某些疾病方面发挥着越来越重要的作用，特别是在我国抗生素将全面禁用的前提下，肠道健康及腹泻将是威胁我国畜牧业发展的瓶颈问题。其中，由猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV)引起的猪流行性腹泻是猪的一种的急性肠道传染病，其主要临床症状为采食量大幅度降低，水样腹泻并且伴随呕吐，严重时脱水，各年龄和品种均可感染，是当前导致仔猪早期死亡的主要疫病之一。研发新的抗生素替代品，筛选具有防治动物腹泻发生，保障动物肠道健康等特定功效的饲用益生菌已成为国内外研究的热点。尽管目前我国已开展了大量的益生菌的筛选工作，并且广泛应用于生产实践，但是这些益生菌主要是用于促进动物肠道营养物质的消化吸收，促进生长，且很多益生菌并非来源于本体动物，进入宿主体内后，很难与宿主适应，难以发挥其确切功效。而且现有的益生菌筛选技术主要包括体外抑菌法和体内攻菌方法，存在着盲目性、效率低和针对性不强、以及多为外源菌等缺点。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提出一种抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法，旨在提高抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法的针对性，提高筛选效率。为实现上述目的，本专利技术提出一种抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法，包括以下步骤：步骤S10、挑选猪流行性腹泻病毒感染的发病仔猪和抗病仔猪，对应采集发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品；步骤S20、提取发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品中的肠道微生物菌群基因组，并对肠道微生物菌群进行高通量测序；步骤S30、对高通量测序的测序数据进行宏基因组学对比分析；步骤S40、根据宏基因组学对比分析的结果，比较发病仔猪和抗病仔猪肠道菌群中的差异菌群、核心菌群和优势菌群，并从只出现在抗病仔猪肠道中的差异菌群中分析出其中的优势菌和核心菌，根据优势菌和和核心菌的分析结果确定待筛选益生菌的目的菌株，然后根据目的菌株的菌落特性，利用选择培养基进行菌株培养，即筛选出抗猪流行性腹泻病毒感染的益生菌。优选地，步骤S10包括：在猪流行性腹泻爆发的猪场，通过临床症状观察和病理损伤检测，并结合猪流行性腹泻病原的定性PCR检测，从定性PCR检测呈阳性的仔猪群中，挑选具有典型临床症状及明显病理损伤的发病仔猪和无典型临床症状及明显病理损伤的抗病仔猪；对应采集发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品，于-80℃保存备用；其中，临床症状观察包括仔猪水样腹泻、呕吐的典型临床症状的观察，病理损伤检测包括仔猪肠内充满黄色液体、肠系膜充血、肠系膜淋巴结水肿以及小肠绒毛缩短的病理损伤的剖检。优选地，步骤S20包括：用试剂盒提取发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品中微生物菌群的基因组，获得微生物菌群中不同微生物的16srRNA基因；利用16srRNA通用引物扩增不同微生物的16srRNA基因，并对扩增片段进行检测和浓度测定后，再利用标签引物进行第二次扩增，并对第二次扩增的片段进行浓度测定，然后将第二次扩增的产物稀释到相同浓度后，等量混合，用以构建测序文库；构建测序文库完成后，将第二次扩增的产物用NaOH进行变性后，利用测序试剂盒和测序仪进行基因序列测定。优选地，步骤S30包括：对高通量测序的测序数据进行α多样性和β多样性分析，对聚类的肠道微生物OTU进行物种诠释，分析发病仔猪和抗病仔猪肠道菌群的物种分布，并分析比较发病仔猪和抗病仔猪肠道的核心菌群和差异菌群。优选地，步骤S40包括：根据宏基因组学对比分析的结果，比较发病仔猪和抗病仔猪肠道菌群中的差异菌群、核心菌群和优势菌群，并从只出现在抗病仔猪肠道中的差异菌群中分析出其中的优势菌和核心菌，根据优势菌和核心菌的分析结果确定待筛选益生菌的目的菌株；将抗病仔猪肠道菌群接种到肉汤培养基中进行厌氧培养，然后对肠道菌群中的目的菌株进行选择培养基固体平板划线培养，再根据目的菌株的菌落特性，挑选选择培养基固体平板上的阳性菌落接种到液体选择培养基中进行增菌培养，即获得所筛选的抗猪流行性腹泻病毒感染的益生菌；对所筛选的益生菌进行生化特性鉴定和16s全基因测序鉴定，鉴定出所筛选的益生菌为约氏乳杆菌和屎肠球菌。优选地，在步骤S40之后，还包括：步骤S50、将所筛选的益生菌接种至试验仔猪体内，然后对试验仔猪进行猪流行性腹泻病毒攻毒试验，统计试验仔猪的腹泻率，根据腹泻率统计结果，分析所筛选的益生菌抗猪流行性腹泻的效果；其中，所述试验仔猪为没有进行猪流行性腹泻病毒免疫的新生仔猪。优选地，步骤S50包括：步骤S51、将没有进行猪流行性腹泻病毒免疫的3日龄仔猪用人工代乳粉饲喂，作为试验仔猪，并随机分为Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组；步骤S52、将所筛选的益生菌进行体外培养后，从3日龄早上开始对试验仔猪接种益生菌，至试验仔猪生长至7日龄，其中，Ⅰ组试验仔猪接种生理盐水，Ⅱ组试验仔猪接种约氏乳杆菌，Ⅲ组试验仔猪接种屎肠球菌，Ⅳ组试验仔猪同时接种约氏乳杆菌和屎肠球菌；步骤S53、于7日龄晚上对Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组试验仔猪使用猪流行性腹泻病毒进行攻毒，攻毒后持续观察48h，记录试验仔猪的腹泻发生情况，统计腹泻率，同时测定试验仔猪肠道组织免疫基因表达量，根据腹泻率统计结果和肠道组织免疫基因表达量，来评判试验仔猪抗猪流行性腹泻病毒的能力。优选地，在步骤S52中：试验仔猪自3日龄至7日龄接种益生菌的剂量依次为5×102cfu/100uL、5×103cfu/100uL、5×104cfu/100uL、5×105cfu/100uL、5×106cfu/100uL；Ⅳ组试验仔猪接种约氏乳杆菌的剂量与接种屎肠球菌的剂量相同。优选地，在步骤S53中：试验仔猪使用猪流行性腹泻病毒进行攻毒的的攻毒剂量为104.5TCID50/100uL；肠道组织免疫基因表达量包括干扰素以及由干扰素诱导产生的抗病毒蛋白的基因表达量。本专利技术提供的抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法，通过对猪流行性腹泻病毒感染的发病仔猪和抗病仔猪肠道菌群的宏基因组学大数据分析入手，有针对性地从抗病仔猪道庞大的微生物菌群中筛选出具有抗流行性腹泻功能的益生菌，所筛选的益生菌来源于本体动物，避免了益生菌与宿主的不适应，且针对性强，避免了筛选的盲目性，提高了筛选效率，节省了大量的人力、物力及时间。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本专利技术提出一种抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法，在本专利技术提供的抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法的一实施例中，所述抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法包括以下步骤：步骤S10、挑选猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的发病仔猪和抗病仔猪，对应采集发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品；在本实施例中，步骤S10包括：在猪流行性腹泻(PorcineEpidemicDiarrhea，PED)爆发的猪场，通过临床症状观察和病理损伤检测，并结合PED病原的定性PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S10、挑选猪流行性腹泻病毒感染的发病仔猪和抗病仔猪，对应采集发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品；步骤S20、提取发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品中的肠道微生物菌群基因组，并对肠道微生物菌群进行高通量测序；步骤S30、对高通量测序的测序数据进行宏基因组学对比分析；步骤S40、根据宏基因组学对比分析的结果，比较发病仔猪和抗病仔猪肠道菌群中的差异菌群、核心菌群和优势菌群，并从只出现在抗病仔猪肠道中的差异菌群中分析出其中的优势菌和核心菌，根据优势菌和和核心菌的分析结果确定待筛选益生菌的目的菌株，然后根据目的菌株的菌落特性，利用选择培养基进行菌株培养，即筛选出抗猪流行性腹泻病毒感染的益生菌。

【技术特征摘要】
1.一种抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S10、挑选猪流行性腹泻病毒感染的发病仔猪和抗病仔猪，对应采集发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品；步骤S20、提取发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品中的肠道微生物菌群基因组，并对肠道微生物菌群进行高通量测序；步骤S30、对高通量测序的测序数据进行宏基因组学对比分析；步骤S40、根据宏基因组学对比分析的结果，比较发病仔猪和抗病仔猪肠道菌群中的差异菌群、核心菌群和优势菌群，并从只出现在抗病仔猪肠道中的差异菌群中分析出其中的优势菌和核心菌，根据优势菌和和核心菌的分析结果确定待筛选益生菌的目的菌株，然后根据目的菌株的菌落特性，利用选择培养基进行菌株培养，即筛选出抗猪流行性腹泻病毒感染的益生菌。2.如权利要求1所述的抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法，其特征在于，步骤S10包括：在猪流行性腹泻爆发的猪场，通过临床症状观察和病理损伤检测，并结合猪流行性腹泻病原的定性PCR检测，从定性PCR检测呈阳性的仔猪群中，挑选具有典型临床症状及明显病理损伤的发病仔猪和无典型临床症状及明显病理损伤的抗病仔猪；对应采集发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品，于-80℃保存备用；其中，临床症状观察包括仔猪水样腹泻、呕吐的典型临床症状的观察，病理损伤检测包括仔猪肠内充满黄色液体、肠系膜充血、肠系膜淋巴结水肿以及小肠绒毛缩短的病理损伤的剖检。3.如权利要求1所述的抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法，其特征在于，步骤S20包括：用试剂盒提取发病仔猪和抗病仔猪的肠道内容物样品中微生物菌群的基因组，获得微生物菌群中不同微生物的16srRNA基因；利用16srRNA通用引物扩增不同微生物的16srRNA基因，并对扩增片段进行检测和浓度测定后，再利用标签引物进行第二次扩增，并对第二次扩增的片段进行浓度测定，然后将第二次扩增的产物稀释到相同浓度后，等量混合，用以构建测序文库；构建测序文库完成后，将第二次扩增的产物用NaOH进行变性后，利用测序试剂盒和测序仪进行基因序列测定。4.如权利要求1所述的抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法，其特征在于，步骤S30包括：对高通量测序的测序数据进行α多样性和β多样性分析，对聚类的肠道微生物OTU进行物种诠释，分析发病仔猪和抗病仔猪肠道菌群的物种分布，并分析比较发病仔猪和抗病仔猪肠道的核心菌群和差异菌群。5.如权利要求1所述的抗仔猪流行性腹泻的饲用益生菌的筛选方法，其特征在于，步骤S40包括：根据宏基因组学对比分析的结果，比较发病仔猪和抗病仔猪肠道...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，侯永清，丁斌鹰，易丹，赵迪，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42