一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法技术

本发明专利技术公开了一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，本发明专利技术方法在PCR扩增前对用作DNA模板的样品DNA进行处理，使3'末端被封闭的含突变位点的核苷酸单链作为杂交链与野生型和突变型序列杂交，双链特异性核酸酶能特异性地移除杂交链与野生型序列形成的完全互补配对的同源双链DNA，但不能移除杂交链与突变型序列形成的非完全互补的异源双链DNA。移除后的产物经PCR扩增，PCR扩增所用的一条引物3'末端位于突变位点上且被封闭，在具有3'‑5'校读活性的聚合酶作用下，使野生型序列不能扩增，但突变型序列得以指数扩增，由此有效富集低丰度基因突变序列，提高了富集灵敏度和准确度，同时本发明专利技术方法还可以同时富集多种突变型序列从而提高扩增效率。

A low abundance gene mutation enrichment method based on the removal of wild type sequences

【技术实现步骤摘要】
一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法。
技术介绍
人类基因组计划的完成推动了基因突变研究的快速发展。近年来，“精准医疗”计划的提出更进一步使基因突变及其检测方法研究成为生物学研究和临床精准医疗的热点和基础。随着检测技术的不断发展，研究人员发现大多数基因突变表现为低丰度(含量从0～100％)，并且这些低丰度基因突变在医学和生物学等领域具有重要的研究意义。不断出现的新方法和技术为低丰度基因突变的富集提供了可靠的前景，这些技术大部分基于PCR技术原理。PCR即聚合酶链式反应，是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，能将微量的DNA大幅增加。PCR反应体系主要包括五种试剂即引物、DNA聚合酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)，PCR反应步骤主要包括预变性、变性、退火和延伸，其中变性、退火和延伸3步的循环运行为核心步骤。变性即通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；退火即当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少；延伸即在DNA聚合酶和4种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，5'→3'的DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，变性、退火和延伸3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106～7拷贝。目前，已经报道了在PCR扩增之前、之中或之后减少野生型序列的方法，但是这些方法通常适用于单个PCR扩增子，或仅适用于序列特异性酶能识别的少数DNA靶标。另外，PCR扩增过程可能引入由碱基错配导致的假阳性，导致基因突变很难和假阳性信息区分开来。近年来，随着高通量技术的出现，移除样本中大量野生型DNA序列的需求日益增加，例如高通量测序文库制备之前移除大量野生型DNA。通常高通量测序无法检测丰度低于～2％的DNA突变，采用移除大量野生型DNA序列的方法能有效富集低丰度突变型序列以期提高测序检测限。本专利技术提供一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，该方法能同时扩增多个PCR扩增子，而且野生型序列移除是在PCR扩增反应前进行的，它能有效避免PCR扩增过程碱基错配导致的假阳性，而且本专利技术中PCR扩增过程通过引入一条引物3'末端位于突变位点上且被封闭，在具有3'-5'校读活性的聚合酶作用下，野生型序列与该引物完全互补而不能继续延伸，而突变型序列由于最后一个错配使错配碱基被切除而继续延伸，使突变型序列进一步得以富集。该方法简单、准确度高，可应用于医学和生物学的许多领域，以推动个体化医疗的发展。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术提供一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变的富集方法，操作简单且准确性更好的富集方法，能同时扩增多个PCR扩增子，且有效避免PCR扩增低丰度突变基因过程中的假阳性问题。本专利技术采用的技术方案是：一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，包括样品DNA提取、样本处理、PCR扩增和结果分析，所述样本处理的步骤包括杂交和消化，所述杂交为首先将提取的样品DNA与杂交链混合得到杂交混合物，所述杂交链为3'末端被封闭的核苷酸单链，所述3'末端被封闭的核苷酸单链的序列根据野生型序列设计和合成且包含突变位点，所述突变位点为所述野生型序列与所述野生型序列的突变型序列相比对碱基不一致的位置，然后将所述杂交混合物于高温变性使所述样品DNA从双链DNA解链为单链DNA，最后降温使所述杂交链与所述单链DNA中的所述野生型序列形成完全互补配对的同源双链DNA和与所述单链DNA中的所述突变型序列形成突变位点碱基错配的非完全互补配对的异源双链DNA；所述消化为在所述杂交得到的产物中加入双链特异性核酸酶并使所述同源双链DNA降解，然后升温使所述双链特异性核酸酶失活，所述双链特异性核酸酶为能够特异性地降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA的热稳定核酸酶；所述PCR扩增的反应体系中的DNA模板为所述消化得到的产物；所述PCR扩增的反应体系中的引物不能与所述杂交链结合，所述引物的扩增片段包含所述突变位点。当然，所述3'末端被封闭的核苷酸单链可以为多种不同的核苷酸序列，所述不同的核苷酸序列包含不同的突变位点，所述引物的对数与所述核苷酸序列的种数相同且每一对引物对应扩增一个含突变位点的片段。因此，本专利技术方法可以富集一种突变型序列也可以同时富集多种突变型序列，即扩增一个扩增子或同时扩增多个扩增子。如果是富集一种突变型序列，那么只需要设计一种序列的3'末端被封闭的包含突变位点的核苷酸单链作为杂交链，和设计一对能扩增含该杂交链对应的突变位点的序列的引物，从而富集一种突变型序列；如果是同时富集多种突变型序列，由于每一种突变型序列不同，各自具有各自的突变位点，则每一种突变型序列均需要根据其突变位点对应设计一种序列的3'末端被封闭的包含该突变位点的核苷酸单链作为杂交链和一对能扩增含该突变位点的序列的引物，因此同时富集多种突变型序列时杂交链为多种不同的核苷酸序列的3'末端被封闭的核苷酸单链，引物也相应为多对，从而能够达到同时富集的目的。优选地，所述反应体系中的DNA聚合酶为具有3'端到5'端核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶，所述引物根据野生型序列设计和合成，所述引物中的正向引物或反向引物的3'末端被封闭且3'末端碱基在所述突变位点上。所述高保真聚合酶可以为PhusionTMDNA聚合酶、KODFXDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶。在PCR扩增过程中，所述3'末端被封闭的正向引物或反向引物的3'端最后一个碱基会与突变型序列在突变位点发生错配，但体系中的高保真DNA聚合酶可以移除该错配碱基而使引物得以延伸，确保了突变型序列的准确、有效富集；此时即使模板中还存有野生型序列，由于其将与3'末端被封闭的正向引物或反向引物完全互补配对而不能被延伸。优选地，所述引物的序列根据突变型序列设计和合成，所述引物的正向引物或反向引物包含所述突变位点。在PCR扩增过程中，所述含突变位点的引物能够与突变型序列完全互补配对结合从而稳定延伸；此时即使模板中还存有野生型序列，由于其与含突变位点的正向引物或反向引物在突变位点发生碱基错配从而降低延伸效率，使突变序列得以大幅扩增。优选地，所述双链特异性核酸酶为能够特异性地降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA的热稳定核酸酶。优选地，所述3'末端被封闭的方法为3'末端的核苷酸被去磷酸化、被氨基化或被巯基化。3'末端被封闭的核苷酸链不能直接被DNA聚合酶延伸。优选地，所述引物扩增的序列的长度在200bp以内。优选地，所述结果分析的方法为焦磷酸测序、Sanger测序或高分辨溶解曲线。本专利技术方法基于PCR技术，但在PCR扩增以前对用作DNA模板的样品DNA进行处理，使3'末端被封闭的含突变位点的核苷酸单链作为杂交链与野生型和突变型序列杂交，双链特异性核酸酶能特异性地移除杂交链与野生型序列形成的完全互补配对的同源双链DNA，但不能移除杂交链与突变型序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，其特征在于，包括样品DNA提取、样本处理、PCR扩增和结果分析，所述样本处理的步骤包括杂交和消化；所述杂交为首先将提取的样品DNA与杂交链混合得到杂交混合物，所述杂交链为3'末端被封闭的核苷酸单链，所述3'末端被封闭的核苷酸单链的序列根据野生型序列设计和合成且包含突变位点，所述突变位点为所述野生型序列与所述野生型序列的突变型序列相比对碱基不一致的位置，然后将所述杂交混合物于高温变性使所述样品DNA从双链DNA解链为单链DNA，最后降温使所述杂交链与所述单链DNA中的所述野生型序列形成完全互补配对的同源双链DNA和与所述单链DNA中的所述突变型序列形成突变位点碱基错配的非完全互补配对的异源双链DNA；所述消化为在所述杂交得到的产物中加入双链特异性核酸酶使所述同源双链DNA降解，然后升温使所述双链特异性核酸酶失活，所述双链特异性核酸酶为能够特异性地降解双链DNA和DNA‑RNA杂交体中的DNA的热稳定核酸酶；所述PCR扩增的反应体系中的DNA模板为所述消化得到的产物；所述PCR扩增的反应体系中的引物不能与所述杂交链结合，所述引物的扩增片段包含所述突变位点。...

【技术特征摘要】
1.一种基于移除野生型序列的低丰度基因突变富集方法，其特征在于，包括样品DNA提取、样本处理、PCR扩增和结果分析，所述样本处理的步骤包括杂交和消化；所述杂交为首先将提取的样品DNA与杂交链混合得到杂交混合物，所述杂交链为3'末端被封闭的核苷酸单链，所述3'末端被封闭的核苷酸单链的序列根据野生型序列设计和合成且包含突变位点，所述突变位点为所述野生型序列与所述野生型序列的突变型序列相比对碱基不一致的位置，然后将所述杂交混合物于高温变性使所述样品DNA从双链DNA解链为单链DNA，最后降温使所述杂交链与所述单链DNA中的所述野生型序列形成完全互补配对的同源双链DNA和与所述单链DNA中的所述突变型序列形成突变位点碱基错配的非完全互补配对的异源双链DNA；所述消化为在所述杂交得到的产物中加入双链特异性核酸酶使所述同源双链DNA降解，然后升温使所述双链特异性核酸酶失活，所述双链特异性核酸酶为能够特异性地降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA的热稳定核酸酶；所述PCR扩增的反应体系中的DNA模板为所述消化得到的产物；所述PCR扩增的反应体系中的引物不能与所述杂交链结合，所述引物的扩增片段包含所述突变位点。2.如权利要求1所述的基于移除野生型序列的低丰度基因突变...

【专利技术属性】
技术研发人员：浦丹，赵珊，舒坤贤，
申请(专利权)人：重庆邮电大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50