【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及包埋切片，具体而言，涉及一种包埋模具、包埋方法及相关应用。
技术介绍
1、包埋切片技术已经被广泛应用各种临床病理组织染色当中，对疾病的诊疗具有重要的作用。包埋切片技术包含石蜡包埋切片和冷冻包埋切片技术。相对于石蜡包埋切片，冷冻包埋切片技术具有制作简单快捷、不受浸蜡和包埋时高温的影响，能够更好的保存组织生物活性的优点，被进一步拓展应用到生命基础科学研究过程当中，如利用空间转录组测序手段对异质组织中生命调控网络基础机制进行解析。
2、冷冻包埋切片技术作为这一新兴研究手段中一个非常重要的实验技术环节，紧密关系到后续实验成功与否及测序数据结果解析。因此在现有冷冻包埋技术上基础上，对包埋工具，包埋条件及后续切片操作进行优化对促进其进一步广泛应用具有重要作用。
3、目前常用的冷冻包埋切片方法基本上是采用液氮结合异戊烷对样品进行速冻。目前常用的包埋工具有三种，并且尺寸都是固定的：
4、1)市场上可购买的专用包埋盒，该种包埋盒长宽范围一般是5mm-20mm，深度一般是5mm-12mm。由于深度比较浅，适用包埋体积较小的组织，但对于体积较大的组织(厚度超过1cm，面积超过2cm)并不能完全覆盖，限制了其进一步应用。
5、2)基于上述限制，也有研究者尝试用细胞培养皿进行包埋，一般所用培养皿的尺寸范围为35cm。可以实现对于体积较大的组织也能完整的覆盖，但后续切片时需要将组织周围多余的oct修剪掉，而oct凝固之后成乳白色，覆盖在组织上方，无法直接观察到组织所在位置，在修剪时有切到组织所在
6、3)还有研究人员采用锡箔纸自制包埋盒，可以根据需要制作不同尺寸包埋盒，但是锡箔纸硬度不够，容易变形，不利于后续操作。
7、其中，现有的冷冻包埋切片操作示例如下：
8、试剂耗材：包埋剂oct、异戊烷、液氮、包埋盒(市场购买专用包埋盒、细胞培养皿或自制锡箔纸盒)。
9、仪器工具：通风橱、大烧杯150ml，小烧杯40ml，镊子，记号笔，小切割刀。
10、1)将包埋剂oct提前置于冰上预冷10min。以下操作除切片外，均在通风橱里面进行。
11、2)准备2个不锈钢烧杯，一大一小(大烧杯150ml，小烧杯40ml)，其中大的加入1/3液氮，小烧杯中加入1/3的异戊烷，将盛有异戊烷的小烧杯放入盛有液氮的大烧杯中，孵育至少10min，预冷异戊烷。
12、3)根据包埋组织尺寸，选择组织包埋盒(购买专用包埋盒，细胞培养皿或自制锡箔纸盒)。
13、4)在包埋盒中加入一层约3mm厚的oct，放置在异戊烷中冷冻直至oct变硬，尽量保持oct表面平整。
14、5)取组织样本，预先确定好组织包埋方向，用镊子轻轻夹起组织放在包埋盒中预铺的oct上。
15、6)调整方向，加入预冷的oct完全覆盖组织，此过程中避免产生气泡，尤其是组织附近。
16、7)用镊子夹起包埋盒放入液氮预冷过的异戊烷中，等待oct完全变硬。
17、8)组织包埋完成，在包埋盒四面标记组织方向，放置在-80度，或者直接进行切片。
18、9)将包埋好组织放置于冷冻切片机中平衡30分钟。
19、10)用镊子插入包好组织样品的oct中，将其从包埋盒中移出，注意不要插到组织样品。
20、11)用小刀对包埋组织的周边oct进行切割修饰，方便后续切片，注意不要切到样品。
21、12)将修饰好的包埋有组织的oct硬块放到铺有一层液态oct的冷冻样品托上面，然后进行速冻固定。
22、13)待组织样品的oct完全被固定后，将组织块固定到冻头上，进行切片。
23、14)将切片贴到玻璃片(以下简称玻片)后进行苏木精—伊红染色(he染色)检测，或贴到时空组芯片上进行后续时空测序。
24、上述方法具有以下缺点：(1)采用液氮结合异戊烷冷冻组织，由于异戊烷具有一定毒性，需要在通风柜中进行，对无通风柜的实验室操作不友好，并且操作相对繁琐；(2)现有包埋工具均存在一定缺点。
25、a.市场化购买专用包埋盒——尺寸固定，通常深度较浅(5mm-12mm)，不适用包埋尺寸较大组织样品。经常出现在模具底部加一层oct之后，组织放上去时，组织的厚度已经超出了模具本身的深度，这样后续无法加oct将组织完全覆盖。还有些组织的体积就已超出模具本身的宽度。并且较难从包埋盒中取出，需要等oct外层稍微融化，再用镊子翘出来。
26、b.细胞培养皿包埋——尺寸固定，可以用较大组织包埋，但是通常用来包埋的培养皿直径也超过35mm。在后续切片时需要修饰组织周围多余的oct，操作起来比较麻烦，需要花更多的时间紧操作，可能影响实验结果。并且因为oct凝固后成乳白色，覆盖在组织上方，无法直接观察到组织所在位置，修饰时一不小心就可能切到组织，同样可以导致实验失败。并且同样较难将从中取出，需要等oct外层稍微融化，再用镊子翘出来。
27、c.自制锡箔纸盒——可以根据需要制作不同尺寸的包埋盒，但是由于材质较薄，容易变形，包埋面不平整，不利于后续操作。
28、此外，以上三种包埋工具均存在一些共同缺点，如：(1)包埋时若与模具底部接触面不平整，容易使模具倾斜，这会导致样品放置倾斜，进而使获得切片并不是想要的切面(如图1左边的培养皿)。(2)模具凹槽不具方向性，包埋组织块一旦从模具中取出就失去了方向，不利于后期结果分析。(3)一种规格的包埋盒，只适用对应尺寸的组织进行包埋，包埋不同大小的组织时候，需要更换不同规格大组织，不够灵活。
29、因此，仍需要对现有的冷冻切片包埋方案进行改进。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种包埋模具、包埋方法及相关应用，以解决现有的包埋模具难以满足多尺寸组织样本包埋的问题。
2、为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种包埋模具，该包埋模具呈底面封闭的方型漏斗状，且包埋模具内壁上标记有刻度线。
3、进一步地，包埋模具包括方型底面以及与方型底面的每条边连接的4个梯形侧面，4个梯形侧面依次连接围成方型漏斗状，在任意一个梯形侧面内壁上标记有刻度线。
4、进一步地，方型底面的面积为(0.5～3)cm×(0.5～3)cm。
5、进一步地，刻度线为设置在梯形侧面内壁上且平行于梯形侧面相连的边的多条直线，多条直线的长度依次为1.0cm、1.5cm、2cm、2.5cm及3cm；优选地，方型底面为正方形，刻度线所在平面的面积分别为1.0cm×1.0cm、1.5cm×1.5cm、2cm×2cm、2.5cm×2.5cm及3cm×3cm。
6、进一步地，包埋模具还包括水平仪，水平仪设置在4个梯形侧面中任意一个或多个梯形侧面的外壁上；优选地，采用粘结性胶带可拆卸地将水平仪设置在梯形侧面的外壁上。
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1.一种包埋模具，其特征在于，所述包埋模具呈底面封闭的方型漏斗状，且所述包埋模具内壁上标记有刻度线。
2.根据权利要求1所述的包埋模具，其特征在于，所述包埋模具包括方型底面以及与所述方型底面的每条边连接的4个梯形侧面，4个所述梯形侧面依次连接围成所述方型漏斗状，在任意一个所述梯形侧面内壁上标记有所述刻度线。
3.根据权利要求2所述的包埋模具，其特征在于，所述方型底面的面积为(0.5～3)cm×(0.5～3)cm。
4.根据权利要求2所述的包埋模具，其特征在于，所述刻度线为设置在所述梯形侧面内壁上且平行于所述梯形侧面相连的边的多条直线，多条所述直线的长度依次为1.0cm、1.5cm、2cm、2.5cm及3cm；
5.根据权利要求2至4中任一项所述的包埋模具，其特征在于，所述包埋模具还包括水平仪，所述水平仪设置在4个所述梯形侧面中任意一个或多个所述梯形侧面的外壁上；
6.根据权利要求5所述的包埋模具，其特征在于，4个所述梯形侧面中的任意一个或多个所述梯形侧面通过卡扣可拆卸地连接，
7.根据权利要求5所述的包埋模具
8.根据权利要求1所述的包埋模具，其特征在于，所述模具的材质选自PVC、PC、PE或PP。
9.一种包埋试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包埋模具，所述包埋模具为权利要求1至8中任一项所述的包埋模具。
10.权利要求1至8中任一项所述的包埋模具在包埋切片中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述应用为冷冻包埋切片。
12.一种冷冻包埋方法，其特征在于，所述包埋方法包括采用权利要求1至8中任一项所述的包埋模具进行包埋。
13.根据权利要求12所述的包埋方法，其特征在于，所述包埋方法包括：
14.根据权利要求13所述的包埋方法，其特征在于，将盛有所述底层OCT的所述模具转移到碎干冰上时，通过所述模具上的水平仪使所述模具保持平衡；
15.一种冷冻切片方法，其特征在于，所述切片方法包括将冷冻包埋组织置于冷冻切片机上进行切片，其中，所述冷冻包埋组织采用权利要求12至14中任意一项所述的包埋方法包埋得到。
16.根据权利要求15所述的切片方法，其特征在于，按照冷冻组织包埋块上带有的标记角调整到预定方向后固定到所述冷冻切片机的冻头上进行切片，得到带有方向性的切片。
...【技术特征摘要】
1.一种包埋模具，其特征在于，所述包埋模具呈底面封闭的方型漏斗状，且所述包埋模具内壁上标记有刻度线。
2.根据权利要求1所述的包埋模具，其特征在于，所述包埋模具包括方型底面以及与所述方型底面的每条边连接的4个梯形侧面，4个所述梯形侧面依次连接围成所述方型漏斗状，在任意一个所述梯形侧面内壁上标记有所述刻度线。
3.根据权利要求2所述的包埋模具，其特征在于，所述方型底面的面积为(0.5～3)cm×(0.5～3)cm。
4.根据权利要求2所述的包埋模具，其特征在于，所述刻度线为设置在所述梯形侧面内壁上且平行于所述梯形侧面相连的边的多条直线，多条所述直线的长度依次为1.0cm、1.5cm、2cm、2.5cm及3cm；
5.根据权利要求2至4中任一项所述的包埋模具，其特征在于，所述包埋模具还包括水平仪，所述水平仪设置在4个所述梯形侧面中任意一个或多个所述梯形侧面的外壁上；
6.根据权利要求5所述的包埋模具，其特征在于，4个所述梯形侧面中的任意一个或多个所述梯形侧面通过卡扣可拆卸地连接，
7.根据权利要求5所述的包埋模具，其特征在于，所述包埋模具还具有包埋方向标记角，所述包埋方向标记角由覆盖任意相邻两个所述梯形侧面形成的内角的平面形成，且所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘田宾，林旭仪，孙海汐，李洁，吴言，董国艺，李建康，顾颖，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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