一种无动物外源成分的小鼠诱导多功能干细胞诱导培养基制造技术

本发明专利技术涉及一种能快速有效诱导小鼠体细胞重编程为多能性干细胞的无动物外源性的培养基，诱导培养基由DMEM基础培养基、NEAA、KSR、LIF以及多种小分子和无机盐所组成，培养基成分明确，无动物外源性污染。本发明专利技术的诱导培养基具有诱导效率高、诱导时间短等优点。对大量获得诱导多功能干细胞、促进干细胞临床应用的发展具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】
一种无动物外源成分的小鼠诱导多功能干细胞诱导培养基
本专利技术涉及干细胞及生物
，具体地，本专利技术涉及一种无动物外源成分的小鼠诱导多功能干细胞诱导培养基。
技术介绍
2006年日本京都大学Yamanaka利用病毒载体将四个转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc转入小鼠胚胎成纤维细胞和尾部皮肤成纤维细胞中，获得形态和生长特性类似ES细胞的克隆，命名为诱导多功能干细胞，也因此获得了2012年诺贝尔生理或医学奖。此后，不同国家的科学家运用相似的方法，运用逆转录病毒作为载体，将四个转录因子导入不同种属的不同细胞，均获得了诱导多功能干细胞。并在之后的研究中通过囊胚注射iPS细胞得到了具有繁殖能力的小鼠，进一步证明了iPS细胞的多能性。在2007年底有科学家用诱导多功能干细胞技术制备了动物疾病模型，随后，对诱导多功能干细胞疾病模型的致病机理和药物筛选的研究迅速发展，诱导多功能干细胞由于其来源广泛、无伦理约束、无免疫排斥反应等优点逐渐成为全球干细胞的研究热点。目前培养诱导多功能干细胞的常规诱导培养基主要包括：DMEM基础培养基、FBS、非必须氨基酸、白血病抑制因子等，而且需要在饲养层上才能成功诱导出多功能干细胞。其中白血病抑制因子的主要作用为防止多功能细胞分化，在双倍量的基础上达到诱导的作用。整个实验体系中有多种动物外源成分污染，即使成功诱导得到多功能干细胞，在实验过程中也不能对其细胞表型的形态变化进行精确分析，对诱导多功能干细胞的进一步研究造成影响。在我国，越来越多的基础实验室开始研究诱导多功能干细胞，而小鼠诱导多功能干细胞的成功制备是各个期望开展诱导多功能干细胞项目的实验室的首要目标。而iPS的研究仍面临两大问题，即得到的iPS纯度以及诱导效率问题。常规的iPS诱导在饲养层上进行，并且诱导培养基中会添加胎牛血清等动物外源性成分，体细胞重编程的效率一般都低于1％，这些问题严重阻碍了对iPS细胞的进一步研究及移植等方面的应用。本专利技术旨在提供一种无动物血清的小鼠多功能干细胞诱导培养基，并在无饲养层体系对小鼠体细胞进行重编程，既能提高诱导效率，缩短诱导时间，又无动物外源成分的污染，在获得大量小鼠iPS细胞的同时节约了时间和人力成本。
技术实现思路
为有助于理解本专利技术，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本专利
的普通技术人员通常理解的含义。除非另外说明，本文中的iPSCs为诱导多功能干细胞的英文简称，KSR为血清替代品的英文简称，NEAA为非必需氨基酸的英文简称，LIF为白血病抑制因子的英文简称，VPA为丙戊酸钠的英文简称，bFGF为碱性成纤维细胞生长因子的英文简称DMEM为基础培养基的英文简称，MEF细胞为小鼠胚胎成纤维细胞的英文简称。除非另外说明，本文中的多功能干细胞和细胞均指诱导多功能干细胞。本专利技术的目的是提供一种无动物外源性成分的小鼠iPSCs诱导培养基。本专利技术的培养基以DMEM为基础培养基，每500mL诱导培养基中还包括以下浓度成分：优选地，本专利技术的培养基以DMEM为基础培养基，每500mL诱导培养基中还包括以下浓度成分：更优选地，本专利技术的培养基以DMEM为基础培养基，每500mL诱导培养基中还包括以下浓度成分：本专利技术的小鼠iPSCs诱导培养基中不含有动物血清，且在无饲养层体系上进行诱导，故无动物外源性成分污染。培养基中添加了非必需氨基酸、白血病抑制因子、碱性成纤维细胞生长因子等成分，在诱导过程中既能诱导体细胞进行重编程，提供所需的营养物质，又能抑制重编程完全的iPSCs细胞进行分化，从而达到高效诱导小鼠体细胞重编程为iPSCs的目的。附图说明图1显示MEF细胞的状态图2显示诱导过程中细胞的形态变化图3显示诱导过程中克隆出现的天数及克隆数图4显示诱导的克隆碱性磷酸酶染色结果图5显示诱导的iPSCs核型鉴定的结果图6显示诱导的iPSCs转录因子和特异性蛋白的表达结果图7显示诱导的克隆多能性基因表面标记免疫荧光染色结果图8显示裸鼠皮下形成的畸胎瘤图9显示畸胎瘤石蜡切片HE染色结果具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、诱导多功能干细胞的诱导培养基的配制本专利技术所述的小鼠iPSCs诱导培养基以DMEM为基础培养基，每500mL诱导培养基中还包括以下成分：在2级生物安全柜中将诱导培养基的各成分充分混合后进行分装，-20℃保存，有效期为10个月。使用时保存于4℃，两周内使用有效。实施例2、MEF细胞的获得MEF细胞购自上海细胞库，经过质量检测，细胞形态如图1所示。从图中可以看出，正常培养的MEF细胞，细胞间界限清晰，呈纺锤状，为典型的纤维细胞形态。实施例3、小鼠iPSCs的诱导本专利技术制备了实施例1的小鼠iPSCs诱导培养基以及等体积的常规多功能干细胞诱导培养基作为对照。小鼠iPSCs的诱导包括以下步骤：首先，通过以下方法将四个多能性基因(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)导入MEF细胞：1)将MEF细胞按1*10^5/孔的密度接种到6孔板上，其中一个孔无饲养层，另一个孔提前一天铺2.5*10^5密度的饲养层细胞；2)1天后，将含有四个多能性基因的病毒各0.5mL混匀，并加入不含抗生素的MEF培养基0.5mL混匀；3)加入聚凝胺，使其终浓度为5μg/mL；4)弃去6孔板中的培养基，用PBS清洗2-3次，将病毒与培养基的混合液加入到6孔板中进行感染；5)在感染的第二天弃去含病毒的培养基，无饲养层与有饲养单层的MEF细胞分别更换为小鼠iPSCs诱导培养基和常规诱导培养基，记为第0天；6)每天进行换液并拍照观察，记录出现克隆的天数以及克隆数。诱导过程中细胞的形态变化如图2所示。从图中可以看出，用本专利技术的小鼠iPSCs诱导培养基诱导的MEF细胞，在第1天即出现了细胞形态变化，细胞缩小，核质比增大，细胞间变得致密，呈现上皮样，而且在第7天iPSCs诱导培养基诱导的MEF细胞已经出现了直径为100μm左右的克隆。从图片观察可知，本专利技术的小鼠iPSCs诱导培养基诱导时间比常规诱导培养基明显缩短而且细胞形态变化更易观察。在诱导过程中记录克隆出现的天数并每天记录一个孔中所出现的克隆数，实验结果如图3所示。从图3可以看出，本专利技术的小鼠iPSCs诱导培养基诱导的MEF细胞在第5天即出现克隆，出现的克隆天数要比用常规诱导培养基在饲养层上诱导的MEF细胞早，且出现的克隆多。当克隆直径达到100μm左右，在显微镜下用机械法挑取，吹散后接种于经AF处理过的24孔板中，换小鼠iPSCs完全培养基，每天进行换液。当克隆再次长至直径100μm左右，即可进行传代或冻存。实施例4、小鼠iPSCs的鉴定1、碱性磷酸酶鉴定胚胎干细胞、诱导多能干细胞和肝细胞等增殖迅速的细胞会大量表达碱性磷酸酶，当干细胞分化后碱性磷酸酶的活性降低，故进行碱性磷酸酶染色可以对获得的克隆进行一个初步鉴定。将获得的多能性干细胞进行培养，到克隆长至100μm左右，用多聚甲醛固定后加入碱性磷酸酶染色液，染色后进行观察并拍照。实验结果如图4所示，从图中可以看出，克隆被碱性磷酸酶染色本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种无动物外源成分的小鼠诱导多功能干细胞诱导培养基，其特征在于，所述培养基以DMEM为基础培养基，还含有NEAA、KSR、LIF以及多种小分子和无机盐等成分。

【技术特征摘要】
1.一种无动物外源成分的小鼠诱导多功能干细胞诱导培养基，其特征在于，所述培养基以DMEM为基础培养基，还含有NEAA、KSR、LIF以及多种小分子和无机盐等成分。2.根据权利要求1所述的无动物外源成分的小鼠诱导多功能干细胞诱导培养基，其特征在于，所述培养基以DMEM为基础培养基，每500mL诱导培养基中还包括以下浓度的组分：。3.根据权利要求1所述的无动物外源成分的小鼠诱导多功能干细胞诱导培养基，其特征在于，所述培养基以DMEM为基础培养基，每500mL诱导培养基中包括以下浓度的组分：。4.根据权利要求1所述的无动物外源成分的小鼠诱导多功能干细胞诱导培养基，其特征在于，所述培养基以DMEM为基础培养基，每500mL诱导培养基中包括以下浓度的组分：。5.根据权利要求1-4中任一项所述的无动物外源成分的小鼠诱导多功能干细胞诱导培养基，其特征在于，所述培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘樱，陈勇，蔡亚雄，彭特，于云飞，乔志平，
申请(专利权)人：广东艾时代生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广东,44