拟康宁木霉液体培养基制造技术

拟康宁木霉液体培养基，它涉及一种真菌液体培养基。解决现有拟康宁木霉液体培养基孢子扩增不理想的缺陷。拟康宁木霉液体培养基中包括KNO3、KH2PO4、MgSO4、FeCl3和蔗糖。本发明专利技术拟康宁木霉液体培养基能够在相同培养条件下提高拟康宁木霉的孢子产量约10倍。本发明专利技术液体培养基具有成分简单、价格低廉等优点，还可以提高拟康宁木霉菌剂的品质。

【技术实现步骤摘要】
拟康宁木霉液体培养基
本专利技术涉及一种真菌液体培养基。
技术介绍
木霉属真菌属于半知菌门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科；有性阶段为子囊菌门的肉座菌属(HypocreaEr.)。木霉属真菌广泛存在于植物种子、根围、球茎、叶围和土壤等自然生态环境中，且对大多数植物病原菌有拮抗作用。1932年，Weindling发现木素木霉(T.lignorum)与立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)共培养时，立枯丝核菌被木素木霉寄生并死亡，Weindling考虑到可以将该木霉应用到植物土传病害的生物防治中，木霉生物防治防研究工作从此开始。目前国际上含有木霉成分的微生物菌剂达到100多种，被60多个国家所使用，而且效果显著，对由病原菌所引起的植物病害防治率高达70％。截止2014年资料，国内外已经过分子序列分析确认存在系统发育关系(或构成全型)的木霉/肉座菌(Trichoderma/Hypocrea)种类达到212个，我国已知木霉属/肉座菌属真菌91种。绿木霉(T.virid)、哈茨木霉(T.harzianum)、钩木霉(T.hamatum)和康氏木霉(T.koningir)等都已经被证实具有生防作用。木霉菌剂在生物防治上的应用方式主要有：(1)土壤处理：将木霉孢子与土壤混合，用来防治枯萎病和立枯病，防治效果达80％以上；(2)种子处理：用木霉孢子粉对种子进行包裹，对于苗木出土前和出土后的猝倒病的防治有特效，并且种子的发芽率要明显高于不用木霉进行包衣；(3)叶面果实喷施：利用木霉TS菌株的孢子悬液对草莓的叶面果实进行喷洒，用来防治草霉灰霉病，其防效均在80％以上；(4)与杀菌剂结合使用：杀菌剂和木霉的组合应用可以明显增强生防效果，既可以降低杀菌剂的用量，同时又降低农药残留量，减少环境污染，减轻农药对环境中有益微生物的破坏。作为工程菌株为了满足工业化生产的需要，大量扩增繁殖是生产应用中必不可少的步骤。木霉属拟康宁木霉在水处理、重金属处理、病原菌防治中都表现出了优异的效果；但是目前拟康宁木霉液体培养基扩大培养效果不尽如人意，培养7天后孢子含量仍只有1.0×108个/ml左右。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适合拟康宁木霉扩大培养的液体培养基，以解决现有拟康宁木霉液体培养基孢子扩增不理想的缺陷。本专利技术拟康宁木霉液体培养基每升中包括10±0.2gKNO3、5±0.1gKH2PO4、2.5±0.1gMgSO4、0.02gFeCl3和50±0.5g蔗糖。本专利技术拟康宁木霉液体培养基能够在相同培养条件下提高拟康宁木霉的孢子产量约10倍。本专利技术液体培养基具有成分简单、价格低廉等优点，还可以提高拟康宁木霉菌剂的品质。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式每升拟康宁木霉液体培养基由10gKNO3、5gKH2PO4、2.5gMgSO4、0.02gFeCl3、50g蔗糖和余量的蒸馏水组成，pH＝6。实施例1马铃薯葡萄糖液体培养基：1L主要由200g马铃薯和20g葡萄糖制成；马铃薯去皮切成约0.5mm见方的小块，取200g放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻璃棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加20g葡萄糖，再补足蒸馏水至1000mL。实施例2普通碳源氮源液体培养基：1L主要由20g蔗糖和3g酵母粉制成；将20g蔗糖和3g酵母粉加入到蒸馏水中，加热使完全溶解，补足蒸馏水至1000mL，调pH至7.0～7.2，121℃灭菌15min。实施例3本专利技术液体培养基：由10gKNO3、5gKH2PO4、2.5gMgSO4、0.02gFeCl3、50g蔗糖和余量的蒸馏水组成，pH＝6。将10gKNO3、5gKH2PO4、2.5gMgSO4、0.02gFeCl3、50g蔗糖加入到蒸馏水中，搅拌溶解，再补足蒸馏水至1000mL，并调pH至6.0，121℃灭菌15min。对比实验：将拟康宁木霉菌原菌种连续转接活化至生长旺盛：拟康宁木霉菌菌种活化，将拟康宁木霉接种于PDA培养基25～27℃活化培养6d～9d；然后将活化后的拟康宁木霉菌接种至PD液体培养基中，在25～27℃摇瓶培养36h～48h，制得液体种子；而后将液体种子接种至液体发酵培养基中，在25～27℃的条件下发酵培养5d；再按发酵液3％的比例加入碳酸钙，混合并用无菌滤布过滤，风干，既得到拟康宁木霉菌剂；其中，液体种子转入一级发酵罐培养，接种量为1％～5％，发酵培养时间为36h～48h；由一级发酵罐接种入二级液体发酵罐，接种量为3％～8％，二级液体发酵培养时间为30h～40h，接种量3％～8％；由二级发酵罐接种入三级液体发酵罐，接种量为5％～10％，通气量1:0.6～0.8(V/V·min)，搅拌速度为200r/min，三级液体发酵培养时间为30h～40h。其中，一级、二级和三级液体发酵罐中的液体培养基成分相同，发酵时间共计5d。分别以实施例1～3的液体培养基作为液体培养基，进行上述实验。实验结果显示，采用实施例1液体培养基培养结束时，培养基中拟康宁木霉的孢子含量约为1.0×108个/ml；采用实施例2液体培养基培养结束时，培养基中拟康宁木霉的孢子含量只有0.6×108个/ml；采用实施例3本专利技术液体培养基结束时，培养基中拟康宁木霉的孢子含量达到1.0×109个/ml。实验结果证明本专利技术拟康宁木霉液体培养基能够在相同培养条件下提高拟康宁木霉的孢子产量至少10倍以上，孢子浓度显著提升。显微镜观察，采用本专利技术液体培养基培养出的拟康宁木霉中有大量厚垣孢子(1～2×107个/ml)，而采用实施例1和2液体培养基培养培养出的拟康宁木霉中未观察到厚垣孢子。本专利技术拟康宁木霉液体培养基可明显提高菌剂品质。将本专利技术液体培养基培养出的拟康宁木霉置于常温条件下保存24个月，活菌数仍可达到4～8×108个/ml，而采用实施例1和2液体培养基培养培养出的拟康宁木霉常温条件下保存24个月，活菌数即<1.0×106个/ml。实验证明采用本专利技术拟康宁木霉液体培养基可以延长菌剂的常温保藏时间。田间病原菌防治效果实验数据与液体培养基中拟康宁木霉活菌数成正比。本文档来自技高网...

【技术保护点】
拟康宁木霉液体培养基，其特征在于每升拟康宁木霉液体培养基中包括10±0.2g KNO3、5±0.1g KH2PO4、2.5±0.1g MgSO4、0.02g FeCl3和50±0.5g蔗糖。

【技术特征摘要】
1.拟康宁木霉液体培养基，其特征在于每升拟康宁木霉液体培养基中包括10±0.2gKNO3、5±0.1gKH2PO4、2.5±0.1gMgSO4、0.02gFeCl3和50±0.5g蔗糖。2.根据权利要求1所述的拟康宁木霉液体培养基，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋清晖，宋福强，
申请(专利权)人：黑龙江省庆东阳光农业生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23