ABO血型基因检测试剂及定型方法技术

本发明专利技术公开了一种用于ＡＢＯ血型抗原和特异性Ａ２抗原同步基因分型的检测试剂及定型方法，含４条引物，其中２条为序列特异性引物，另２条为内对照引物，可以对中国人群常见的ＡＢＯ血型抗原及特异性Ａ２亚型抗原的血型基因进行同步扩增。检测中国人群最为常见的Ａ１０１、Ａ１０２、Ｂ１０１、Ｏ０１　４种等位基因与Ａ２０１、Ａ２０２、Ａ２０３、Ａ２０４、Ａ２０５、Ａ２０６　６个所有的Ａ２等位基因。与传统的检测方法相比，本发明专利技术是一种快速、简单、实用、特异和敏感的检测方法。适合中国汉族人ＡＢＯ血型基因的鉴定以及用于人类ＡＢＯ血型的研究。

【技术实现步骤摘要】
ABO血型基因检测试剂及定型方法本专利技术涉及一种新的分子生物学检测试剂及方法；尤其涉及一种用于ABO 血型抗原和特异性A2抗原同步基因分型的检测试剂及定型方法。ABO血型系是人类血型系中抗原免疫原性最强的一个血型系统。人类的 ABO血型系统是由由第9号染色体(9q34.1 q34.2)上的A、 B和O三个等位 基因来控制的，基因通过决定生成的转糖基酶的种类而决定催化何种糖基连接在 前驱物质的哪个位置上。A、 B抗原都是在H抗原(前驱物质半乳糖末端连接岩 藻糖)的基础上形成的，细胞合成的A酶能使一个乙酰半乳糖胺基连接到H抗 原上，形成A抗原；B抗原是一个半乳糖基连接到H抗原上。根据人类红细胞 表面有无抗原A、 B和H，可分为A型、B型、AB型和O型四型，组成ABO 血型系统。A型红细胞上有A抗原，B型者有B抗原，AB型者有A和B两种 抗原，而O型者两种抗原均无但有H抗原。目前人类ABO血型检测方法有二种 一是经典的血清学方法，二是基因方 法。血清学方法的缺点是需要新鲜红细胞，需要抽血检验；而基因方法可以弥补 这方面的缺陷，因此基因定型方法已逐步运用于临床血型检测中。ABO基因定型方法原理如下鉴于ABO基因产物是糖基转移酶，这些酶控 制ABO血型抗原的生物合成。ABO抗原的化学结构是糖蛋白，其血清学特异性 取决于糖链末端3个糖基的结构。ABO基因包含长度大小从28-688bp不等的7 个外显子和长度约为19514bp的6个内含子,它大约总长为18-20Kb。多数编码序 列(1062bp中823bp)位于第6和第7外显子上，它们编码了糖基转移酶的催化 区域。ABO血型的其它等位基因的DNA序列高度保守，与A101 —致序列的 DNA序列紧密相关，仅有几个碱基替换或单个碱基缺失。A102等位基因与A101 等位基因相比只是在467位的单个碱基替换(C/T， Pro/Leu)，两者翻译的糖基转移酶活力没有显著性差异。B 1基因仅在297、 526、 657、 703、 796、 803、 930 和1096位碱基8个位置与A101基因有改变，导致糖基转移酶多肽链上有4个 氨基酸替代C526G(Arg/Gly) 、 G703A(Gly/Ser) 、 C796A(Leu/Met)、 G803C(Gly/Ala)。 01基因与A101的差异是第261位核苷酸G缺失，引起了阅 读框移动，在351至354位置产生终止密码子，肽链合成在117位氨基酸终止， 产生一条无催化能力的短肽链。ABO基因定型方法克服了以往血型血清学方法的限制，可作为一种独立的 鉴定手段，为临床解决ABO亚型的鉴定、血型抗原减弱反应、Cis-AB (顺式 AB型)、类孟买型、血型嵌合体、正反定型不符等疑难问题，在临床输血医学 和遗传学等领域将具有广泛的应用。但鉴于不同民族不同人种的基因构成存在明显差异，采用什么样的检测试剂进行基因检测，有不同的检测效果。研究表明(喻琼,吴国光，邓志辉，等.中国汉族人群A2亚型分子遗传背景的 研究.中国输血杂志，2004,17 (2): 83~86):中国汉族人群与别的人种ABO血 型基因分布相比有着自己的特点，中国人群中Al、 B、 01基因较常见，其中A102 基因频率高达0.2231， A101基因频率仅为0.0096，无02基因；中国人群A2 等位基因存在多样性并有其自身特点，与国际报道的基因构成存在明显差异， A2等位基因中除ntl061C缺失外，还存在nt467 0T、 ntl009A〉G等点突变，中 国汉族人群A2亚型中以A205等位基因(nt467T、 ntl009G)为主。有多个课题组的研究支持中国人群ABO常见血型基因的分布情况(Yan L, Zhu F, Fu Q, He J. ABO, Rh,廳S， Duffy, Kidd, Yt， Scianna, and Colton blood group systems in indigenous Chinese. Immunohematol. 2005;21(1): 4-10) Al等位基因 (0.1890); A2等位基因(0.0045)， B等位基因(0.2340)， 0-l等位基因(0.6380)，未 检出O02基因。当前，使用国外设计的ABO常规分型试剂盒并不适合中国人群ABO基因 的鉴定。有研究表明(喻琼,吴国光，邓志辉，等.中国汉族人群A2亚型分子遗传 背景的研究.中国输血杂志,2004,17 (2): 83~86)使用以国际报道的ABO基因 结构特点为基础、美国G&T公司研制的PCR-SSP法ABO基因定型试剂盒，对 260例中国汉族的随机个体进行了基因定型，但未检出A2基因且对20例血清学 检出为"A2"亚型的样本，使用美国G&T公司研制的PCR-SSP法ABO基因定型试剂盒，仅有5例能定为A2型，而绝大部分标本不能正确定型，只能定为 Al型。表1 国外试剂盒中ABO基因分型参数<table>table see original document page 8</column></row><table>目前国内没有适合中国人群常见ABO血型抗原和特异性A2抗原同步基因 分型的试剂盒。如果在基因检测中没有针对中国人A2亚型基因特异性的引物，会造成不正 确定型，可能会误定为A1型。A2亚型是ABO血型中常见的变异型，随着临床 医学的发展,人们对它的重要性认识越来越深刻。譬如近十年来，发现A2亚型的 器官(心脏、肝、肾脏等)供者捐给非A型(包括B型、O型)的受者显著延 长存活率、加大了供体库的数量；A2亚型的成分(血小板)血液可称为"万能" 成分血。准确的定型具有重要的实际意义。针对现有技术存在的问题，本专利技术构思了一种新的用于ABO血型抗原和特 异性A2抗原同步基因分型的检测试剂及定型方法，可以克服现有技术的缺陷。 本专利技术是这样实现的一种ABO血型基因检测试剂，可以对中国人群常见的ABO血型抗原的血 型基因进行同步扩增，包括2条内对照寡核苷酸引物 HGH-A链序列5'-tgc ctt ccc aac cat tec cct ta-3，， HGH-B链序列5，-cca etc acg gat ttc tgt tgt gtt tc-3，，其特征在于，还至少包括下述任意一组2条基因特异性寡核苷酸引物(1) Mix-A 5'陽gga agg atg tec teg agg tg-3.5，-tga gga tgt gga tgt tga at -3，(2) Mix-A1025，-acg tgg ctt tec tga tgc tg-3， 5，-gcg ggg cac cgc ggc ca-3，(3) Mix-B5，-ctg tea gtg ctg gac gtg g-3， 5，-tec acg cac acc agg taa tc-3，(4) Mix-05，-gga agg atg tec tec tgg ta-3， 5，-ctt gat ggc aaa cac agt taa c-3又一种ABO血型基因检测试剂，可以对中国人群常见的ABO血型特异性 A2亚型抗原的血本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＡＢＯ血型基因检测试剂，包括２条内对照寡核苷酸引物：　ＨＧＨ－Ａ链序列：５’－ｔｇｃ　ｃｔｔ　ｃｃｃ　ａａｃ　ｃａｔ　ｔｃｃ　ｃｃｔ　ｔａ－３’，　ＨＧＨ－Ｂ链序列：５’－ｃｃａ　ｃｔｃ　ａｃｇ　ｇａｔ　 　ｔｔｃ　ｔｇｔ　ｔｇｔ　ｇｔｔ　ｔｃ－３’，　其特征在于，还至少包括下述任意一组２条基因特异性寡核苷酸引物：　（１）Ｍｉｘ－Ａ　５’－ｇｇａ　ａｇｇ　ａｔｇ　ｔｃｃ　ｔｃｇ　ａｇｇ　ｔｇ－３’　 ５’－ｔｇａ　ｇｇａ　ｔｇｔ　ｇｇａ　ｔｇｔ　ｔｇａ　ａｔ－３’　（２）Ｍｉｘ－Ａ１０２　５’－ａｃｇ　ｔｇｇ　ｃｔｔ　ｔｃｃ　ｔｇａ　ｔｇｃ　ｔｇ－３’　５’－ｇｃｇ　ｇｇｇ　ｃａｃ　ｃｇｃ 　ｇｇｃ　ｃａ－３’　（３）Ｍｉｘ－Ｂ　５’－ｃｔｇ　ｔｃａ　ｇｔｇ　ｃｔｇ　ｇａｃ　ｇｔｇ　ｇ－３’　５’－ｔｃｃ　ａｃｇ　ｃａｃ　ａｃｃ　ａｇｇ　ｔａａ　ｔｃ－３’　（４）Ｍｉｘ－Ｏ　 　５’－ｇｇａ　ａｇｇ　ａｔｇ　ｔｃｃ　ｔｃｃ　ｔｇｇ　ｔａ－３’　５’－ｃｔｔ　ｇａｔ　ｇｇｃ　ａａａ　ｃａｃ　ａｇｔ　ｔａａ　ｃ－３。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邓志辉，喻琼，
申请(专利权)人：深圳市血液中心，
类型：发明
国别省市：94[中国|深圳]