尿激酶原突变体制造技术

本发明专利技术涉及具血栓溶解活性的尿激酶原突变体，它由天然尿激酶原的氨基酸序列组成，但对其３０９位的脯氨酸进行定点突变，该突变使尿激酶原变体的内在活性（即单链活性）比天然尿激酶原低２．５～２０倍，表现为血纤维蛋白原溶解活性以及非特异性血纤维蛋白溶解酶原激活作用的下降。与天然尿激酶原相比，该突变体对纤维蛋白溶解酶原的激活作用不仅可被纤维蛋白降解的Ｅ片段，而且可被纤维蛋白降解的Ｄ片段所促进。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在血栓溶解治疗中使用的新型尿激酶原，特别是具血栓溶解活性的尿激酶原突变体。尿激酶原是一种单链丝氨酸蛋白酶原，经纤维蛋白溶解酶(Plasmin)的激活而形成双链尿激酶(UK)。尿激酶原和尿激酶均能使纤维蛋白溶解酶原(Plasminogen)激活为纤维蛋白溶解酶，纤维蛋白溶解酶则可将血栓中的纤维蛋白及其它血浆蛋白降解，因此尿激酶原和尿激酶可用于血栓栓塞的治疗。与其它丝氨酸蛋白酶原相比，尿激酶原的一个显著特点是其具有很高的内在活性(Intrinsic Activity)，表现为对小分子底物的水解能力以及对纤维蛋白溶解酶原的激活作用。尽管上述活性较尿激酶低250倍左右，但其内在活性仍比其它丝氨酸蛋白酶原(如胰蛋白酶原或糜蛋白酶原)高104.0～4.3倍。尿激酶原对纤维蛋白溶解酶原的激活作用存在较长的延迟，当反应系统中存在纤维蛋白降解的E片段时，则可使上述激活作用显著增强，纤维蛋白及其降解片段D对上述反应没有显著影响。尿激酶原相对较高的内在活性，使其在临床使用时会产生一些不良的副作用。和尿激酶一样，尿激酶原也能引起非特异性的纤维蛋白溶解酶原活化，从而导致纤维蛋白原的降解以及血小板和血管壁的部分溶解，产生系统性的纤溶状态，引发出血或中风等并发症。在低剂量使用时，尿激酶原比尿激酶更具有选择性，这是因为尿激酶对游离的或与纤维蛋白结合的纤维蛋白溶解酶原的激活作用均很强。而尿激酶原的内在活性仅为尿激酶的0.2％～0.5％，在低浓度时它对结合了纤维蛋白的纤维蛋白溶解酶原优先激活而对游离的纤维蛋白溶解酶原的激活作用则很弱。但是，为了确保血栓溶解的疗效而使用高剂量时，尿激酶原就丧失了其低剂量时的特异性。本专利技术的目的就是为了解决上述问题，提出一种具有优良血栓溶解作用的尿激酶原突变体。我们对尿激酶原溶解血栓的作用机理研究结果表明，尿激酶原或尿激酶对血栓表面的纤维蛋白溶解酶原的活化以及纤维蛋白溶解酶对血栓附近尿激酶原的激活，是血栓溶解过程的两个关键步骤。因此，与野生型尿激酶原相比，一个具有良好疗效的尿激酶原变体应具备①较低的内在活性，以保证临床使用的安全性；②对与血栓结合的纤维蛋白溶解酶原具有较高的激活作用，而对游离的纤维蛋白溶解酶原的活化能力很弱，这可通过改变尿激酶原的底物专一性而实现；③该变体被纤维蛋白溶解酶激活的速度应与野生型尿激酶原相当，且其对应的双链尿激酶激活纤维蛋白溶解酶原的能力应与野生型尿激酶相似本专利技术是基于下列发现天然尿激酶原分子中Lys300与Asp355之间的静电相互作用(盐键)是维持其高内在活性的必要条件，因此，任何削弱上述静电相互作用的氨基酸突变均可能使尿激酶原变体的内在活性下降。当Pro309被突变为其它氨基酸后，可以改变Lys300的空间位置，从而影响Lys300和Asp355之间的静电作用，并使突变体的内在活性降低。此外，该位点的突变不仅可以影响突变体双链尿激酶的活性，而且可以改变(单链)突变体的底物专一性，使其对游离纤维蛋白溶解酶原的激活作用下降，而对与纤维蛋白或其降解片段结合的纤维蛋白溶解酶原的激活能力上升。与天然尿激酶原相比，该位点的一些尿激酶原突变体是优良的血栓溶解药剂，因为它们对纤维蛋白溶解酶原的激活作用受纤维蛋白促进的程度超过天然尿激酶原，因而，这些尿激酶原突变体对与纤维蛋白结合的纤维蛋白溶解酶原的激活作用表现出比天然尿激酶原更强的特异性，此外由于其低内在活性，因此在给患者施用这些尿激酶原变体时，可比天然尿激酶原使用更高、更有效验的剂量。因此本专利技术的特征在于一种有溶解血栓活性的尿激酶原突变体，它具有天然尿激酶原的氨基酸序列，但对其第309位的脯氨酸进行突变，该突变可使其内在活性比天然尿激酶原低2.5倍以上，并使其对纤维蛋白溶解酶原的激活作用可被纤维蛋白及其降解片段所促进。当给患者施用时，该突变使其可以诱导出比天然尿激酶原更低的纤维蛋白原溶解作用和非特异性纤维蛋白溶解酶原激活作用，并使其表现出较高的纤维蛋白特异性。本文中使用的术语“天然”是指一种天然存在或野生型形式的蛋白质，或者指天然存在的蛋白质中的一种天然存在或野生型形式的氨基酸。一种“新”氨基酸是指天然蛋白质内通常不定位于给定位点上的氨基酸，具体地说，在尿激酶原第309位除脯氨酸之外的其它氨基酸。本专利技术的特征还在于一种DNA分子，例如，一种重组DNA分子，该分子编码本文中描述的任何突变型尿激酶原。本专利技术还包括一种用上述的DNA分子转化的细胞，例如一种哺乳动物、细菌或酵母细胞。本专利技术的特征还在于一种制备本文中描述的突变型尿激酶原的方法，该方法包括用编码一种突变型尿激酶原的DNA分子转化一种细胞，培养该细胞，以及表达该突变体，并分离该突变体(蛋白)。实施例尿激酶原突变体的制备适用于制备本文中描述的尿激酶原突变体的一种方法是寡聚核苷酸定点突变，这种方法可使天然尿激酶原的核苷酸序列在特定位点发生改变，并可导致其编码的氨基酸序列在相应位点改变为其它氨基酸。编码天然尿激酶原的基因序列已被完全鉴定，并可从例如Dr.David Dichek(NIH)和Dr.Paolo Sarmientos(Primm，Milano，Italy)处得到。在ATCC的保藏号为DNA 57329或细菌/噬菌体57328。用UKHU名称可在NIH计算机数据库Protein Identity Resource中检索其核酸和氨基酸序列。天然尿激酶原的氨基酸序列见附图说明图1。目前用于进行核苷酸定点突变的技术已非常成熟，本文以Stratagene的突变试剂盒(试剂目录号#200518)为例，说明尿激酶原基因在对应于Pro309密码子处的定点突变，见图2。用包含尿激酶原(cDNA)基因并具有甲基化修饰的质粒为模板，以含有突变序列的寡核苷酸为引物，在经变性和退火处理后，使寡核苷酸引物与质粒模板配对，并以具有高复制保真度的pfu DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸以合成含有尿激酶原突变基因并与质粒模板互补配对的DNA。该反应可在PCR仪器上完成，在经过大约15次左右的变性—退火—延伸反应后，所得产物已足够用于转导感受态细菌。取上述合成产物2μl，加入DpnI酶，该酶可以选择性地降解含甲基化的DNA链，而使用作模板的含野生型尿激酶原基因的质粒DNA被降解，并失去转导感受态细菌的能力，而用Pfu DNA聚合酶在体外合成的含有尿激酶原定点突变的DNA则因不存在甲基化而不能被降解，并可互补配对为含有缺口(nick)的双链DNA。该双链DNA可有效地转导至大肠杆菌感受态细胞中。挑选阳性克隆并对其质粒DNA中的尿激酶原基因序列进行鉴定，从而获得含有定点突变的尿激酶原基因。我们将Pro309随机突变为其它19种氨基酸，以比较各突变体的内在活性及其对纤维蛋白溶解酶原激活的特导性。我们设计以下寡核苷酸引物用于尿激酶原Pro309密码子的随机突变引物1.ACAG TCA TTT TCA GCT GCT CNN NAT AGA GAT AGTCGG TAG AAT TC引物2.GAA TTC TAC CGA CTA TCT CTA TNN NGA GCA GCTGAA AAT GAC TGT其中N代表A，T，C，G尿激酶原突变体DNA的表达根据用于蛋白表达的宿主细胞类型，将含有突变本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有血栓溶解活性的尿激酶原（ｐｒｏ－ＵＫ）突变体，它基本上是由天然尿激酶原的氨基酸序列组成，其中所述序列含有突变。该突变使尿激酶原变体的内在活性（即单链活性）比天然尿激酶原低２．５～２０倍。当给患者使用时，该变体可产生比天然尿激酶原更低的血纤维蛋白原溶解活性以及非特异性血纤维蛋白溶解酶原激活作用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙自勇，刘建宁，
申请(专利权)人：刘建宁，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]