一种尿激酶原基因突变体及其制备方法技术

一种尿激酶原基因突变体及其制备方法，它在保持蛋白质的氨基酸组成和序列不变的前提下，在基因序列的5’端增加了两个核苷酸G和T，在序列的3’端增加了核酸内切酶Sal1的识别序列GTCGAC，其基因突变体的核苷酸序列为序列表1；其制备方法包括（1）合成单链核苷酸片段；（2）PCR产生双链DNA片段；（3）拼接尿激酶原基因突变体的全序列；（4）尿激酶原基因突变体序列测定和分析；本发明专利技术通过人工合成全基因的方法，不仅优化了全部遗传密码子，而且对基因两端进行了适当修饰，使之易于进行测序分析和构建表达载体等进一步基因操作；从而开发一种适宜在大肠杆菌中表达的新型尿激酶原基因，以便通过大肠杆菌发酵技术生产尿激酶原。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及。
技术介绍
尿激酶原(pro-UK,单链尿激酶性纤溶酶原激活剂，scu-PA)是一种单链丝氨酸蛋白酶原，成熟蛋白分子由411个氨基酸残基组成，分子量54KD。尿激酶原在纤溶酶、胰蛋白酶和激肽释放酶等作用下，在158位赖氨酸和159位亮氨酸(Ile)之间发生断裂，断裂之后形成的A和B两条肽链，两条链通过第148位与第279位的半胱氨酸(Cysl48-Cys279)之间形成的二硫键相互连 在一起，形成高分子尿激酶(HMW-UK)。高分子尿激酶的分子量与尿激酶原相同。高分子尿激酶能在纤溶酶作用下进一步发生水解，在Lysl35-Lysl36之间产生断裂，失去前面的135个氨基酸，形成低分子量尿激酶(LMW-UK)。尿激酶原、高分子量尿激酶和低分子量尿激酶均能激活纤维蛋白溶解酶原(plasminogen),使之成为纤维蛋白溶解酶(plasmin)。纤维蛋白溶解酶可以将血栓处的纤维蛋白和和其它血浆蛋白降解。因此，尿激酶原、高分子尿激酶和低分子尿激酶均能用于血栓治疗。但是，作为溶解血栓的药物，以尿激酶原最为安全，因为它在到达栓塞部位之前是没有活性的，到达治疗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种尿激酶原基因突变体，其特征在于在保持蛋白质的氨基酸组成和序列不变的前提下，在基因序列的5’端增加了两个核苷酸G和T，在序列的3’端增加了核酸内切酶Sal1的识别序列GTCGAC，其基因突变体的核苷酸序列为序列表1；突变基因序列包含一系列密码子替换；密码子代换的详细资料如下：第34位亮氨酸的密码子从CTA变为CTT，第64位异亮氨酸的密码子从ATA变为ATC，第79位精氨酸的密码子从CGA变为CGT，第107位组氨酸的密码子从CAC被更换成CAT，第108位精氨酸的密码子从AGA变为CGC，第123位精氨酸的密码子从AGG变为CGC，第128、129、130位连续三个精氨酸的密码子从CGG?...

【技术特征摘要】
1.一种尿激酶原基因突变体，其特征在于在保持蛋白质的氨基酸组成和序列不变的前提下，在基因序列的5’端增加了两个核苷酸G和T，在序列的3’端增加了核酸内切酶Sall的识别序列GTCGAC，其基因突变体的核苷酸序列为序列表I ;突变基因序列包含一系列密码子替换；密码子代换的详细资料如下:第34位亮氨酸的密码子从CTA变为CTT，第64位异亮氨酸的密码子从ATA变为ATC，第79位精氨酸的密码子从CGA变为CGT，第107位组氨酸的密码子从CAC被更换成CAT，第108位精氨酸的密码子从AGA变为CGC，第123位精氨酸的密码子从AGG变为CGC，第128、129、130位连续三个精氨酸的密码子从CGG CGA AGG变换为CGC CGT CGC，第198位和199位两个精氨酸的密码子从AGG AGG变为CGC CGT,第201位精氨酸的密码子从CGG变换成CGC，第243位精氨酸的密码子从AGG变为CGT，第273位组氨酸的密码子从CAC变为CAT，第287位精氨酸密码由AGG变为CGC，第293位精氨酸密码子从AGG变为CGT，第295位异亮氨酸的密码子从ATA更换为ATT，第343位精氨酸的密码子从CGG变为CGC，第411位精氨酸的密码子从AGA变换成CGC。2.如权利要求1所述的一种尿激酶原基因突变体的制备方法，其特征在于所述的制备方法包括以下步骤: (1)合成单链核苷酸片 段 采用单链DNA片段合成方法，它按照尿激酶原基因突变体的序列设计，从基因5’端到3’端划分为20个片段，分别进行合成；设计出的20个合成片段，涵盖尿激酶原基因全部411个氨基酸的编码序列，合成基因5’端起始于尿激酶原天然分子的首位氨基酸丝氨酸的密码子AGC，其3’端结束于翻译终止密码子TGA ;为了便于进一步基因操作，便于用特异的表达载体在大肠杆菌中生产出天然尿激酶原蛋白质分子，借助基因两端引物的合成，预先对合成基因的两个末端做出适当处理；在5’端增加了两个核苷酸GT，为的是在把基因插入表达载体时能够恢复蛋白酶Xa的识别位点第4个氨基酸精氨酸的编码；同时，为便于将基因插入表达载体，在其3’端增加了一个核酸内切酶识别位点GTCGAC ;这20个合成片段的主要特点有两个:第一，20个片段依基因序列按顺序从头至尾排列；第二，1、3、5.. 等奇数片段的核苷酸排列与基因正链相同，2、4、6... 等偶数片段的核苷酸序列与基因的负链相同；第三，相邻两个片段有13-15个碱基互补，可以退火连接在一起； (2)PCR产生双链DNA片段 为了应用PCR延伸技术获得双链DNA，这些片段的序列资料取自双链DNA分子的两条互补链；标有奇数的片段的DNA序列,其核苷酸排列顺序与mRNA的核苷酸排列完全相同；而标有偶数的片段的DNA序列，其核苷酸序...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈永福，熊晓云，
申请(专利权)人：南昌市万华生化药业有限公司，
类型：发明
国别省市：