一种构建FK520高产工程菌株的方法和吸水链霉菌高产菌株技术

本发明专利技术提供了一种稳定高产FK520(子囊霉素)的工程菌株，所述菌株的基因组中整合有基因表达盒，所述的基因表达盒表达乙基丙二酰辅酶A生物合成基因所编码的蛋白。本发明专利技术的改造菌株可显著提高FK520的产量，并提高主产物FK520与副产物FK523的组分比例(质量比)。

A method for the construction of high yield strain of FK520 and high yield strain of Streptomyces bibulus

The invention provides an engineering strain for stable and high-yield FK520 (azacycin). The gene expression cassette is integrated into the genome of the strain, and the gene expression cassette expresses the protein encoded by ethyl propyl two acyl coenzyme A biosynthesis gene. The modified strain of the invention can significantly increase the yield of FK520 and increase the component ratio (mass ratio) of the main product FK520 and the byproduct FK523.

【技术实现步骤摘要】
一种构建FK520高产工程菌株的方法和吸水链霉菌高产菌株
本专利技术涉及生物技术工程领域，具体地，涉及一种构建FK520优产工程菌株的方法和吸水链霉菌高产菌株。
技术介绍
FK520又名子囊霉素(ascomycin)，是一种23元大环内酯类抗生素，具有免疫抑制、神经保护再生和抗真菌等活性。FK520属于钙调磷酸酶抑制剂，其作用机制主要是通过抑制白细胞介素-2的产生从而抑制T淋巴细胞的免疫活性；FK520对白细胞介素-2的抑制活性比环孢菌素A更强。FK520还能够抑制中性粒细胞中的IL-8的产生，其对IL-8的抑制活性比环孢菌素A高10倍，而雷帕霉素则不具备对IL-8的抑制活性。因此，FK520具有巨大的药用潜力。此外，临床使用的新一代特应性皮炎治疗药物匹美莫斯(pimecrolimus)，是FK520的C-32位羟基氯代衍生物，工业上是直接以FK520为原料药通过化学半合成生产。目前，FK520主要通过吸水链霉菌大量发酵生产获得，国内有关FK520菌株改造和发酵技术的相关研究正在开展中，但尚未能够用于工业生产，因此迫切需要开发有效的FK520高产菌株构建方法。在吸水链霉菌的发酵过程中，FK520为主产物，FK523为副产物。FK523的存在一方面由于分流作用降低了FK520的发酵效价，另一方面，其结构相似性也给FK520纯品的分离造成了困难，增加了分离纯化步骤的成本，因此迫切需要提高FK520在发酵组分中所占的比例。然而，由于FK520和FK523共用相同的生物合成途径，因此通常的基因操作方法对FK520的组分优化效果不明显。因此，本领域迫切需要开发构建基因工程FK520高产菌的方法，以满足临床需求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种构建基因工程FK520高产菌的方法及其应用。本专利技术第一方面提供了一种稳定高产FK520(子囊霉素)的工程菌株，所述菌株的基因组中整合有基因表达盒，所述的基因表达盒表达乙基丙二酰辅酶A生物合成基因所编码的蛋白。在另一优选例中，所述乙基丙二酰辅酶A生物合成基因选自下组：3-氧酰基-酰基载体蛋白合酶III(KSIII)编码基因pnP5、巴豆酰辅酶A还原酶(CrotonylCoAreductase,CCR)编码基因pnP6、或其组合。在另一优选例中，所述菌株包括链霉菌属。在另一优选例中，所述菌株为吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)，较佳地，为吸水链霉菌子囊亚种Streptomyceshygroscopicusvar.ascomyceticusATCC14891。在另一优选例中，所述的基因组中整合有1-20个(较佳地，1-10个，更佳地，1-5个)所述的基因表达盒。在另一优选例中，所述基因表达盒表达3-氧酰基-酰基载体蛋白合酶III(KSIII)编码基因pnP5、和/或巴豆酰辅酶A还原酶(CrotonylCoAreductase,CCR)编码基因pnP6编码的蛋白。在另一优选例中，所述基因表达盒包括串联基因表达盒。本专利技术第二方面提供了一种生产FK520(子囊霉素)的方法，包括步骤：(i)培本专利技术第一方面所述的工程菌株，从而获得含FK520(子囊霉素)的发酵产物；和(ii)从所述发酵产物中分离出FK520(子囊霉素)。本专利技术第三方面提供了一种构建本专利技术第一方面所述菌株的方法，包括步骤：(a)构建含有基因表达盒的载体，所述表达盒具有以下元件：phiC31整合酶基因，噬菌体附着位点靶序列PhiC31attP，属间接合元件oriT，阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV，和目的基因,所述的目的基因为乙基丙二酰辅酶A生物合成基因；(b)将步骤(a)获得的含有所述基因表达盒的载体转入受体菌株，获得受体基因组整合有所述基因表达盒的菌株。在另一优选例中，还包括步骤(c)：PCR验证步骤(b)得到的整合有基因表达盒的菌株的基因型；和/或步骤(d)：发酵检测得到的整合有基因表达盒菌株的FK520(子囊霉素)的产量；和/或步骤(e)：发酵检测得到的整合有基因表达盒菌株的FK520(子囊霉素)与FK523的比例。在另一优选例中，步骤(a)所述的目的基因选自下组：3-氧酰基-酰基载体蛋白合酶III(KSIII)编码基因pnP5、巴豆酰辅酶A还原酶(CrotonylCoAreductase,CCR)编码基因pnP6、或其组合。在另一优选例中，所述基因表达盒包括串联基因表达盒。在另一优选例中，步骤(a)所述的目的基因为3-氧酰基-酰基载体蛋白合酶III(KSIII)编码基因pnP5和巴豆酰辅酶A还原酶(CrotonylCoAreductase,CCR)编码基因pnP6。在另一优选例中，步骤(a)所述的载体为质粒、黏粒或核酸片段。在另一优选例中，步骤(a)所述的表达盒还含有强启动子元件。在另一优选例中，所述的强启动子元件包括红霉素抗性基因强启动子。在另一优选例中，所述的强启动子元件为红霉素抗性基因强启动子ermEp*。在另一优选例中，所述强启动子元件为1-3个，较佳地，1-2个，更佳地，为2个。在另一优选例中，步骤(a)所述的载体还包括抗性基因元件，较佳地为阿泊拉霉素抗性基因。在另一优选例中，步骤(a)所述的表达盒具有以下元件：强启动子元件ermEp*、目的基因pnP5和/或pnP6、phiC31整合酶基因、噬菌体附着位点靶序列PhiC31attP、属间接合元件oriT、和阿泊拉霉素抗性基因acc(3)IV。在另一优选例中，步骤(b)所述受体基因组整合的基因表达盒(优选串联基因表达盒)数量为1-5个，较佳地为1-3个。在另一优选例中，步骤(b)所述的受体菌株具有附着位点attB。在另一优选例中，步骤(b)所述的整合为载体PhiC31attP位点和受体基因组attB位点之间的位点特异性整合。在另一优选例中，PhiC31attP位点和attB位点之间整合后形成重组杂合位点attL和attR。在另一优选例中，attL的核心核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，attR的核心核苷酸序列如SEQIDNO：10所示。在另一优选例中，attL的核心核苷酸序列与SEQIDNO：9序列的同源性为70-100％，attR的核心核苷酸序列与SEQIDNO：10序列的同源性为70-100％本专利技术第四方面提供了一种本专利技术第一方面所述工程菌株的用途，它被用作发酵生产FK520(子囊霉素)及其衍生物的工程菌。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了FK520、FK523的化学结构，其中，图1A显示了FK520的化学结构，图1B显示了FK523的化学结构。图2显示了FK520的C-21位侧链来源前体乙基丙二酰辅酶A的生物合成途径。图3显示了由PhiC31整合酶介导的位点特异性重组过程：出发菌株染色体上的附着点为attB，载体上携带的噬菌体附着位点为attP，PhiC31整合酶催化attP/attB之间的重组，形成杂合位点attL和attR。图4显示了基因表达质粒pSETerm-pnP5P6的结构：该质粒是pSET152衍生质粒，包含了串联的乙基丙二酰辅酶A生物合成相本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种稳定高产FK520(子囊霉素)的工程菌株，其特征在于，所述菌株的基因组中整合有基因表达盒，所述的基因表达盒表达乙基丙二酰辅酶A生物合成基因所编码的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种稳定高产FK520(子囊霉素)的工程菌株，其特征在于，所述菌株的基因组中整合有基因表达盒，所述的基因表达盒表达乙基丙二酰辅酶A生物合成基因所编码的蛋白。2.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述乙基丙二酰辅酶A生物合成基因选自下组：3-氧酰基-酰基载体蛋白合酶III(KSIII)编码基因pnP5、巴豆酰辅酶A还原酶(CrotonylCoAreductase,CCR)编码基因pnP6、或其组合。3.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述菌株包括链霉菌属。4.如权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述基因表达盒表达3-氧酰基-酰基载体蛋白合酶III(KSIII)编码基因pnP5、和/或巴豆酰辅酶A还原酶(CrotonylCoAreductase,CCR)编码基因pnP6编码的蛋白。5.一种生产FK520(子囊霉素)的方法，其特征在于，包括步骤：(i)培养权利要求1所述的工程菌株，从而获得含FK520(子囊霉素)的发酵产物；和(ii)从所述发酵产物中分离出FK520(子囊霉素)。6.一种构建权利要求1所述菌株的方法，其特征在于，包括步骤：(a)构建含有基因表达盒的载体，所述表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐功利，姜浩，潘海学，赵娟，李岩，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，黑龙江威凯洱生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31