过表达异源谷氨酰胺合成酶的基因工程菌及其构建方法技术

本发明专利技术提供一种过表达异源谷氨酰胺合成酶的谷氨酸棒杆菌基因工程菌及其构建方法。合成并优化来源于嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnA；通过酶切连接的方法，将基因glnA连接在大肠杆菌‑谷氨酸棒杆菌穿梭型表达载体pXMJ19上，构建了表达载体pXMJ19glnA；将表达载体pXMJ19glnA导入谷氨酸棒杆菌GM34或谷氨酸棒杆菌TP607，构建基因工程重组菌GM34/pXMJ19glnA或TP607/pXMJ19glnA。本发明专利技术所述基因工程菌过表达外源谷氨酰胺合成酶，显著提高了L‑谷氨酰胺的产量。同时在L‑色氨酸生产菌中过表达该酶，L‑色氨酸产量显著提高。

【技术实现步骤摘要】
过表达异源谷氨酰胺合成酶的基因工程菌及其构建方法
本专利技术涉及一种过表达异源谷氨酰胺合成酶的谷氨酸棒状杆菌基因工程菌及其构建方法与应用，属于微生物代谢调控和基因工程

技术介绍
细胞内一些重要的酶促反应依赖L-谷氨酰胺提供氨基供体转氨反应，L-谷氨酰胺脱氨基后生成L-谷氨酸。L-谷氨酰胺的再生是通过谷氨酰胺合成酶催化L-谷氨酸和铵盐反应来完成的。细胞内L-色氨酸、氨基葡萄糖、透明质酸等的合成涉及谷氨酰胺转氨反应，其大量积累需要L-谷氨酰胺的快速合成。然而，谷氨酰胺合成酶会发生腺苷酰化现象，导致其酶活急剧降低。AMP以共价键方式与谷氨酰胺合成酶肽链上的酪氨酸残基(Tyr)结合使得其发生腺苷酰化反应，进而使谷氨酰胺合成酶活性降低甚至丧失。在铵盐极大程度地超过需求量时，腺苷酰化程度加强，谷氨酰胺合成酶活性下降甚至失活，但L-谷氨酰胺的生成又不可缺少铵盐供应。此外，在氨基酸、有机酸等发酵过程中，由于胞内产物积累导致pH下降，此时常规微生物谷氨酰胺合成酶的酶活较低。目前，L-谷氨酰胺的生成菌株由于谷氨酰胺合成酶会发生腺苷酰化的现象，其活力会急剧降低，严重限制了L-谷氨酰胺的合成和生产。因此，寻求高活性谷氨酰胺合成酶来强化细胞内L-谷氨酰胺的再生，在生物合成L-色氨酸等产品中具有重要的应用价值。专利申请CN106635946A公开了一种谷氨酸棒杆菌，具有L-谷氨酰胺生产能力并且其细胞内编码腺苷酰基转移酶的glnE基因和编码谷氨酰胺酶的glsA基因被敲除。专利申请CN1884501A公开了一种可解除腺苷酰化修饰作用的谷氨酰胺合成酶，是自氨基端第405位氨基酸残基突变为L-苯丙氨酸的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的谷氨酰胺合成酶。专利申请CN1550546A公开了一种具有L-精氨酸或L-赖氨酸生产能力的棒杆菌，该棒状杆菌经过修饰，使其通过腺苷酰化对谷氨酰胺合成酶的活性调节作用被减少或消除，使其谷氨酰胺合成酶的活性得到提高。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种过表达异源谷氨酰胺合成酶的谷氨酸棒杆菌基因工程菌。本专利技术技术方案如下：所述谷氨酰胺合成酶来源于嗜酸乳杆菌，由基因glnA编码，在GENEBANK上的编号为3251394。本专利技术在谷氨酸棒杆菌基因工程菌中过表达来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶。为了保证该异源基因的表达水平，在蛋白质氨基酸序列保持不变的前提下，对该异源基因进行了密码子优化，优化前后的基因序列分别如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。本专利技术的克隆载体为pUC57，该载体用来保存合成基因glnA。本专利技术的表达载体为pXMJ19，该载体是大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭型载体，自身包含tac启动子同时该启动子受IPTG诱导。本专利技术的宿主细胞为谷氨酸棒杆菌GM34，该菌株是一株L-谷氨酰胺产生菌株。本专利技术的另一宿主细胞为谷氨酸棒杆菌TP607，该菌株是一株L-色氨酸产生菌株。本专利技术谷氨酸棒杆菌基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)根据GenbankID：3151394，合成并优化来源于嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnA；(2)通过酶切连接的方法，将基因glnA连接在大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭型表达载体pXMJ19上，构建了表达载体pXMJ19glnA；(3)将表达载体pXMJ19glnA导入谷氨酸棒杆菌GM34，构建基因工程重组菌GM34/pXMJ19glnA；(4)通过酶切连接的方法，将谷氨酸棒杆菌自身的谷氨酰胺合成酶基因glnA1连接在大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭型表达载体pXMJ19上，构建了表达载体pXMJ19glnA1；(5)将表达载体pXMJ19glnA1和对照载体pXMJ19导入谷氨酸棒杆菌GM34，构建基因工程重组菌GM34/pXMJ19glnA1和GM34/pXMJ19；(6)将表达载体pXMJ19glnA和对照载体pXMJ19导入谷氨酸棒杆菌TP607，构建基因工程重组菌TP607/pXMJ19glnA和TP607/pXMJ19。本专利技术构建基因工程菌的应用：基因工程菌合成谷氨酰胺合成酶应用于发酵法和酶法生产L-谷氨酰胺，以及强化发酵过程中细胞内的转氨反应，有利于L-色氨酸等产品的生产。基因工程菌合成谷氨酰胺合成酶应用于酶法和发酵法生产L-谷氨酰胺，同时也能够应用于L-色氨酸、氨基葡萄糖和透明质酸等产品的生产。本专利技术所述基因工程菌过表达外源谷氨酰胺合成酶，显著提高了L-谷氨酰胺的产量。同时在L-色氨酸生产菌中过表达该酶，L-色氨酸产量显著提高。本专利技术具有如下优点和有益效果：(1)据本专利技术，在谷氨酸棒杆菌GM34中分别过表达内源和来源于嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶得到菌株GM34/pXMJ19glnA1和GM34/pXMJ19glnA，在pH5.0，pH6.0，pH7.0条件下，分别测定谷氨酸棒杆菌GM34、GM34/pXMJ19glnA1和GM34/pXMJ19glnA谷氨酰胺合成酶的酶活。发现在pH7.0条件下，3株菌的谷氨酰胺合成酶活最高，其中过表达内源谷氨酰胺合成酶菌株的酶活比出发菌GM34的酶活略高，而GM34/pXMJ19glnA谷氨酰胺合成酶的酶活是菌株GM34/pXMJ19glnA1的3.9倍。此外，3株菌谷氨酰胺合成酶的酶活随着pH的降低而减小，其中菌株GM34/pXMJ19glnA谷氨酰胺合成酶的酶活分别是GM34/pXMJ19glnA1酶活的3.8倍(pH6.0)和4.5倍(pH5.0)。说明来源于嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶无论是在中性条件还是酸性条件下，均显著高于谷氨酸棒杆菌自身的酶活。(2)GM34/pXMJ19glnA和GM34/pXMJ19分别进行5L发酵罐补料分批发酵，发酵时间到48h，发现过表达嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶的菌株GM34/pXMJ19glnAL-谷氨酰胺的产量达到39±1g/L，是原菌株GM34/pXMJ19(29±1g/L)的1.34倍。(3)对菌株TP607/pXMJ19glnA和TP607/pXMJ19分别进行摇瓶发酵，发酵时间48h，发现过表达嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶的菌株GM34/pXMJ19glnAL-色氨酸产量达到11.4±0.20g/L，是原菌株TP607/pXMJ19(8.0±0.15g/L)的1.43倍。附图说明图1：pXMJ19glnA单双酶切凝胶电泳验证；其中，M:1kbDNAmarker；1:pXMJ19glnA双酶切产物；2：pXMJ19glnA单酶切产物。图2：不同浓度蛋白质的标准曲线。图3：不同pH下3菌株谷氨酰胺合成酶的酶活。图4：HPLC测定L-谷氨酰胺标准曲线。图5：谷氨酸棒杆菌GM34/pXMJ19谷氨酰胺发酵过程曲线。图6：谷氨酸棒杆菌GM34/pXMJ19glnA谷氨酰胺发酵过程曲线。图7：谷氨酸棒杆菌TP607/pXMJ19和TP607/pXMJ19glnAL-色氨酸摇瓶发酵结果。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本专利技术方法。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而本文档来自技高网...

【技术保护点】
过表达异源谷氨酰胺合成酶的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酰胺合成酶来源于嗜酸乳杆菌，其在谷氨酸棒杆菌基因工程菌中的编码基因的序列如SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.过表达异源谷氨酰胺合成酶的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酰胺合成酶来源于嗜酸乳杆菌，其在谷氨酸棒杆菌基因工程菌中的编码基因的序列如SEQIDNO：2所示。2.如权利要求1所述过表达异源谷氨酰胺合成酶的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主菌为谷氨酸棒杆菌GM34或谷氨酸棒杆菌TP607，表达载体为pXMJ19。3.权利要求1或2所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌的用途，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌过表达外源谷氨酰胺合成酶，应用于发酵生产L-谷氨酰胺或L-色氨酸。4.如权利要求3所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌的用途，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌应用于发酵生产L-谷氨酰胺，5L发酵罐补料分批发酵48h，L-谷氨酰胺的产量达到39±1g/L，和/或达到原宿主菌产量的1.34倍。5.如权利要求3所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌的用途，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌基因工程...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢希贤，李燕军，李娟，陈宁，徐庆阳，张成林，范晓光，马倩，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12