LIGHT作为免疫佐剂制备重组病毒疫苗制造技术

本发明专利技术提供了LIGHT作为免疫佐剂在制备EBV和HPV的重组病毒疫苗中的应用以及所制备的重组病毒疫苗。LIGHT作为免疫佐剂增强疫苗刺激机体产生抗体、诱发机体产生体液免疫应答、刺激淋巴细胞分泌IFN‑γ、刺激机体产生细胞免疫应答的能力。制备的重组病毒疫苗包括重组EBV疫苗或重组HPV疫苗。本发明专利技术提供的LIGHT免疫佐剂，在病毒疫苗诱导的机体免疫应答反应中，能够高效提高疫苗免疫效率，是一种良好的重组病毒疫苗免疫增强剂；其制备的重组病毒疫苗通过LIGHT介导的信号通路增强机体对疫苗的免疫应答反应、特异性抗体的产生和T淋巴细胞的活化和增殖，发挥高效抗病毒作用。

LIGHT as an immune adjuvant to prepare recombinant virus vaccine

The present invention provides the application of LIGHT as an immune adjuvant in the preparation of recombinant viral vaccines for EBV and HPV and the prepared recombinant virus vaccine. LIGHT as an adjuvant to enhance the ability of the vaccine to stimulate the body to produce antibodies, induce humoral immune response, stimulate the secretion of IFN gamma, induce cell immune response. The recombinant virus vaccines prepared include recombinant EBV vaccine or recombinant HPV vaccine. LIGHT adjuvants provided by the invention, the immune response induced by the vaccine, can effectively enhance the immune efficiency of the vaccine, is a good kind of recombinant virus vaccine immune enhancer; the signal pathway of prepared recombinant virus vaccine by LIGHT mediated enhancement of the immune response to the vaccine, specific antibody the T production and activation and proliferation of lymphocytes, effective antiviral effect.

【技术实现步骤摘要】
LIGHT作为免疫佐剂制备重组病毒疫苗
本专利技术属于疫苗领域，涉及LIGHT作为免疫佐剂制备重组病毒疫苗，具体而言，本专利技术涉及LIGHT作为免疫佐剂在制备EBV和HPV的重组病毒疫苗中的应用以及所制备的重组病毒疫苗。
技术介绍
免疫佐剂简称佐剂，是免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂主要通过以下作用机制发挥免疫增强作用：1)延缓抗原的降解和排除，提高抗原的半衰期，更有效刺激免疫系统；2)刺激巨噬细胞和树突状细胞(DC)，增强其处理和抗原提呈的能力；3)刺激淋巴细胞的增殖和分化，提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴度；4)改变抗体的产生类型以及产生迟发型变态反应。佐剂主要可分为两种：一种本身具有免疫原性。如结核分支杆菌和百日咳杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、矿物油乳剂和表面活性剂等。随着生命科学基础理论的发展，尤其是免疫学、病毒学、传染病学和基因工程技术的不断发展，现代疫苗学研究日新月异。科学研究的深入，新型疫苗的开发，迫切需求新型免疫佐剂。新型疫苗主要由基因工程重组抗原或化学合成多肽组成，但存在抗原递呈和抗原表达及疫苗免疫反应性弱等问题，急需新型免疫佐剂的研究。并且，新型免疫佐剂不仅要求安全性高、打破机体免疫耐受，刺激更强地体液和细胞免疫应答，更要切合新型疫苗，如粘膜疫苗、DNA疫苗和肿瘤治疗性疫苗。目前已开发的新型免疫佐剂，如细胞因子白介素1、2和12、CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)、脂质体佐剂和热休克蛋白佐剂等，均是直接增强机体免疫应答；而现今多种病毒性疾病和肿瘤，都是机体免疫抑制信号通路活化，导致T淋巴细胞活化受抑制，从而产生免疫耐受，使机体对病毒感染无应答或弱的免疫反应。如何增强疫苗的免疫原性、克服病毒及病毒感染细胞的免疫逃逸、诱导细胞免疫、提高疫苗的安全性和特异性等是疫苗研究的核心和难点问题。
技术实现思路
为了解决上述存在的技术问题，本专利技术的目的在于将疫苗和免疫调节相结合，具体提供LIGHT作为免疫佐剂在制备EBV和HPV的重组病毒疫苗中的应用。本专利技术还提供pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒作为免疫佐剂制备的重组病毒DNA疫苗；本专利技术还提供LIGHT蛋白作为免疫佐剂制备的重组病毒蛋白疫苗，旨在为开发更高效病毒疾病和肿瘤的预防和治疗性疫苗奠定基础。本专利技术的目的通过以下技术方案得以实现：本专利技术提供LIGHT作为免疫佐剂在制备EBV和HPV的重组病毒疫苗中的应用。上述应用中，优选地，所述LIGHT包括LIGHT基因、LIGHT蛋白、和/或pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒；所述重组病毒疫苗为重组EBV疫苗或重组HPV疫苗。上述应用中，优选地，LIGHT作为免疫佐剂增强疫苗刺激机体产生抗体、诱发机体产生体液免疫应答、刺激机体产生细胞免疫应答的能力。本专利技术还提供LIGHT作为免疫佐剂制备的重组病毒疫苗，所述LIGHT包括pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒和/或LIGHT蛋白；所述重组病毒疫苗包括重组病毒DNA疫苗和/或重组病毒蛋白疫苗；所述重组病毒DNA疫苗由pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒联合病毒DNA疫苗获得；所述重组病毒蛋白疫苗由LIGHT蛋白联合病毒蛋白疫苗获得。本专利技术还提供一种重组病毒DNA疫苗，其采用上述pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒作为免疫佐剂，其是按照包括以下步骤的制备方法制备得到的：利用LIGHT基因与pcDNA3.1(+)质粒构建重组表达载体pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒；pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒与病毒DNA疫苗联合获得重组病毒DNA疫苗。根据实际操作，所述pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒与所述病毒DNA疫苗质量比例可以根据个体差异等因素进行适当调整，优选为1:1-10:1。上述重组病毒DNA疫苗中，优选地，所述病毒DNA疫苗包括EBVDNA疫苗和/或HPVDAN疫苗。上述重组病毒DNA疫苗中，优选地，构建重组表达载体pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒的步骤为：PCR扩增LIGHT基因并与pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切；酶切后的LIGHT基因与pcDNA3.1(+)质粒连接；连接后的产物转化宿主细胞，培养宿主细胞，筛选并酶切鉴定，获得阳性克隆重组表达载体pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒。上述重组病毒DNA疫苗中，优选地，PCR扩增的LIGHT基因与pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切，利用相同的酶分别进行酶切反应，酶切体系分别如表1-1和表1-2所述。表1-1为PCR产物载体酶切体系，表1-2为pcDNA3.1(+)载体酶切体系。LIGHT基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。表1-1表1-2上述重组病毒DNA疫苗中，优选地，酶切后的LIGHT基因与pcDNA3.1(+)质粒连接步骤如下：将上述双酶切后的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，将酶切后的LIGHT融合基因同pcDNA3.1(+)质粒进行连接，22℃连接1h，连接反应体系如表1-3所述：表1-3上述重组病毒DNA疫苗中，优选地，对连接后的产物转化宿主细胞，培养宿主细胞，筛选并酶切鉴定，获得阳性克隆重组表达载体pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒，具体操作步骤如下：1)将连接后的产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB固体平板培养基，37℃培养过夜，挑取单菌落培养后提取质粒并酶切鉴定，酶切体系如表1-4所示：表1-42)于37℃下酶切4小时，1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，鉴定的阳性克隆载体命名为pCDNA3.1(+)-LIGHT。上述重组病毒DNA疫苗中，优选地，所述病毒DNA疫苗包括EBVDNA疫苗和/或HPVDAN疫苗。本专利技术还提供一种重组病毒蛋白疫苗，其是采用LIGHT蛋白作为免疫佐剂联合病毒蛋白疫苗获得的，所述LIGHT蛋白是由上述pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒转染宿主细胞表达筛选获得。所述LIGHT蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。上述重组病毒蛋白疫苗中，优选地，所述LIGHT蛋白是通过上述pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒转染293T细胞后表达鉴定筛选获得的，具体操作方法如下：按实验室分子克隆常规方法将无内毒素pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒转染到已生长密度达80％的293T细胞，在5％CO2、37℃条件下用10％FBSDEME培养基培养48h后，分离和收集细胞培养上清及细胞，利用LIGHT单克隆抗体，采用WesternBlot分析并鉴定细胞及细胞培养上清液中LIGHT融合蛋白的表达，SDS-PAGE电泳及WesternBlot方法参照分子克隆实验指南进行，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％，浓缩胶80V恒压，分离胶120V恒压跑约2小时；在转膜缓冲液体系下100V恒压，转膜90分钟，经封闭后依次加入LIGHT单克隆抗体，经洗涤后，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体进行WesternBlot鉴定；筛选获得LIGHT蛋白。LIGHT蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。上述重组病毒蛋白疫苗中，所述LIGHT蛋白作为免疫佐剂与病毒蛋白疫苗联合获得重组病毒蛋白疫苗，优选地，所述病毒蛋白疫苗可以包括人乳头本文档来自技高网...

【技术保护点】
LIGHT作为免疫佐剂在制备EBV和HPV的重组病毒疫苗中的应用。

【技术特征摘要】
1.LIGHT作为免疫佐剂在制备EBV和HPV的重组病毒疫苗中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LIGHT包括LIGHT基因、LIGHT蛋白、和/或pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒；所述重组病毒疫苗为重组EBV疫苗或重组HPV疫苗。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，LIGHT作为免疫佐剂增强疫苗刺激机体产生抗体、诱发机体产生体液免疫应答、刺激机体产生细胞免疫应答的能力。4.LIGHT作为免疫佐剂制备的重组病毒疫苗，其特征在于，所述LIGHT包括pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒和/或LIGHT蛋白；所述重组病毒疫苗包括重组病毒DNA疫苗和/或重组病毒蛋白疫苗；所述重组病毒DNA疫苗由pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒联合病毒DNA疫苗获得；所述重组病毒蛋白疫苗由LIGHT蛋白联合病毒蛋白疫苗获得。5.一种重组病毒DNA疫苗，其采用权利要求4所述的pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒作为免疫佐剂，其是按照包括以下步骤的制备方法制备得到的：利用LIGHT基因与pcDNA3.1(+)质粒构建重组表达载体pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒；pcDNA3.1(+)-LIGHT质粒与病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：王蒲，邹军辉，卢晓华，郑威，赵琦，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44