田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子及其基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子的氨基酸序列。本发明专利技术还公开了田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子基因，包含编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。本发明专利技术田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子，对细胞具有抗氧化保护作用，适用于筛选治疗巴贝斯虫病的硫氧还蛋白抑制剂药物。

【技术实现步骤摘要】
田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子及其基因和应用
本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子及其基因和应用。
技术介绍
田鼠巴贝斯虫(Babesiamicroti)是顶复门的一类单细胞虫体。寄生于家畜如牛马，宠物犬，野生动物以及鸟类等。田鼠巴贝斯虫也可感染人类，从而威胁到人群的健康和食品安全。巴贝斯虫寄生于宿主红细胞内,分裂繁殖并产生毒素，破坏红细胞，因而感染巴贝斯虫病后出现溶血性贫血血红蛋白尿,严重病例可导致死亡。此致病性原虫呈全球性分布，主要集中在欧洲和美国，近年来，在云南、内蒙等地和中国台湾地区均出现人感染巴贝斯虫的病例报告。到目前，只有少数药物用于巴贝斯虫病的治疗，且效果尚不稳定，因此对于巴贝斯虫的感染生存机制的研究是药物靶标设计的基础。红细胞通过把分子氧还原成H2O以获取能量,也不可避免地产生氧化物、超氧化物等还原产物，又触发生物体内自由基的链式反应。红细胞中产生的H2O2和O2-不仅对其本身具有毒性，也对红细胞中生存与繁殖的巴贝斯虫具有攻击作用。巴贝斯虫必须具有自身防御系统或借助于宿主细胞的防御系统来抵御宿主红细胞的氧化作用。为了抵御氧化压力，寄生虫利用硫氧还蛋白系统来维持氧化还原平衡，这个系统包括NADPH、硫氧还蛋白(Trx)和NADPH依赖的硫氧还蛋白还原酶(TrxR)。在感染疟原虫的红细胞中，硫氧还蛋白系统是疟原虫体对抗过氧化物的主要防御体系。因此，为了找到药物靶标，需要研究田鼠巴贝斯虫Trx的特点，以便针对药物靶标设计合理的抑制剂。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子及其基因，该田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子可用于制备治疗巴贝斯虫病的药物。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:在本专利技术的一个方面，提供了一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子，具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。在本专利技术的另一方面，提供了一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子基因，其包含：编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。优选的，所述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的另一方面，还提供了一种重组载体，包含上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子基因的核苷酸序列。所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体。在本专利技术的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的宿主细胞。在本专利技术的另一方面，还提供了一种抑制上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子活性的硫氧还蛋白抑制剂。将本专利技术的田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子作为药物靶标，可以筛选出一系列与其直接或间接作用并抑制其活性的抑制剂。在本专利技术的另一方面，还提供了一种抗寄生虫疫苗，包含上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子。将本专利技术的田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子作为免疫抗原免疫动物后，可以刺激机体产生抗体等免疫反应。在本专利技术的另一方面，还提供了一种包含上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子的抗氧化剂。在本专利技术的另一方面，还提供了一种用上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子免疫动物制得的抗血清。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子的应用，用于制备或筛选治疗巴贝斯虫病的药物。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子的应用，用于制备诊断田鼠巴贝斯虫感染的产品，该产品包括试剂盒或生物芯片。本专利技术田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子，经实验表明对细胞具有抗氧化保护作用，适于筛选治疗巴贝斯虫病的硫氧还蛋白抑制剂药物。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例1的BmTrx1全长基因序列及编码氨基酸序列图；图2是本专利技术实施例1的BmTrx1基因与其他物种Trx1的氨基酸序列比对图；图3是本专利技术实施例2的重组蛋白rBmTrx1/His的表达与纯化结果图；图4是本专利技术实施例3的WesternBlotting检测结果图；图5是本专利技术实施例4的重组蛋白rBmTrx1/His的酶活检测结果图；图6是本专利技术实施例5的重组蛋白rBmTrx1/His对细胞的抗氧化保护实验结果图。具体实施方式本专利技术首次从田鼠巴贝斯虫虫体中获得一个新的硫氧还蛋白分子，简称BmTrx1，将其基因编码区克隆到表达载体，在大肠杆菌中进行重组表达，由酶活性实验分析重组蛋白rBmTrx1/His对胰岛素的还原活性，并通过实验验证重组蛋白rBmTrx1/His对细胞具有抗氧化保护作用。实施例1田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子(BmTrx1)的基因克隆和序列分析1.材料与方法1.1.寄生虫与实验动物田鼠巴贝斯虫购自美国标准菌库(ATCC)下的ATCCRPRA-99TM，在本实验室经过昆明小鼠传代增殖和保存。1.2.细菌与质粒大肠杆菌DH5α(Invitrogen)和大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)用于质粒构建及蛋白表达。测序载体为pGEM-TEasy(Promega)，表达载体为pET30avector(Novagen)。1.3.田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白(BmTrx1)的分子克隆收集经田鼠巴贝斯虫感染的小鼠红细胞，破碎后，离心收集虫体。经TRIzolreagent(Invitrogen)提取虫体RNA，然后用DNaseⅠ(TOYOBO)去除虫体基因组DNA。并用ReverseTranscriptionSystemKit(TaKaRa,Dalian,China)将虫体总RNA反转录为cDNA。根据本实验室构建的田鼠巴贝斯转录组文库，筛选出Trx1基因的EST序列。根据文库中序列设计5’RACE和3’RACE引物，分别为：5’RACE的5’GSPTrx-1：5'-CGCAACATGGTGTGGACCTTG-3'(SEQIDNO.3)、5’GSPTrx-2：5'-GCTTAGTTTCGGTGAGTGATGCG-3'(SEQIDNO.4)和5'nested-GSPTrx-3：5'-GCAAGGTCCACACCATGTTGCG-3'(SEQIDNO.5)；3′RACE的3'GSP1：5'-CGCAACATGGTGTGGACCTTG-3'(SEQIDNO.6)和3'GSP2:5'-GACGGGGCTGTTGTAGATTCGTG-3'(SEQIDNO.7)。经SMARTerRACEcDNAamplificationkit(Clintech,SanJose,CA,USA)扩增得到3’末端和5’端序列，扩增产物纯化后连接到克隆载体pGEM-TEasy(Promega)中进行测序。2.结果BmTrx1全长432bp(SEQIDNO.2)，编码104个氨基酸(SEQIDNO.1)。预测蛋白分子量为11.3kDa，无信号肽序列(见图1)。在GenBank中进行BLAST非冗余数据库分析，结果显示BmTrx1的预测氨基酸序列与牛双芽巴贝斯虫(Babesiabigemina)Trx(XP_012767416)同源性为54％，与其他物种肝片吸虫(Fasciolahepatica)Trx(AAF14217)的同源性为44％，与恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)Trx(XP_001348719)同源性为47％，与泰勒虫(TheileriaparvastrainMuguga)Trx(XP_763852)同源性为50本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子，具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2.一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子基因，其包含：编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的硫氧还蛋白分子基因，其特征在于，所述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.一种重组载体，其特征在于，包含：权利要求2或3所述的田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白分子基因的核苷酸序列。5.一种抑制权利要求1所述田鼠巴贝斯虫硫氧...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚海燕，周金林，张厚双，曹杰，周勇志，海旭南，赵少若，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31