一种马驽巴贝斯虫病荧光PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物学检测技术领域，具体涉及一种基于荧光定量PCR标量阳性对照建立的马驽巴贝斯虫病检测试剂盒，用于马属动物感染马驽巴贝斯虫病的临床诊断和日常监测。本发明专利技术通过设计检测引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示和荧光探针如SEQ ID No.3所示，结合荧光定量PCR系统绝对定量分析，通过优化反应体系和循环条件，建立马驽巴贝斯虫病荧光PCR检测方法。并建立一种基于荧光定量PCR标量的马驽巴贝斯虫病荧光PCR检测试剂盒，适用于马驽巴贝斯虫病的临床诊断和流行病学监测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物学检测
，具体涉及一种基于荧光定量PCR标量阳性对照建立的马驽巴贝斯虫病检测试剂盒，用于马属动物感染马驽巴贝斯虫病的临床诊断和日常监测。
技术介绍
马驽巴贝斯虫病是由马驽巴贝斯虫(Babesiacaballi)寄生于马属动物红细胞内所引起的一种血液原虫病，病畜多表现为贫血、黄疸、高热稽留、厌食、消瘦等临床症状。本病尤其对出入境动物危害严重，被OIE列为B类疫病。目前，市面上流通的治疗马驽巴贝斯虫病的药物效果一般，由于新疆特殊的地理环境条件，媒介蜱分布广而多，该病的发病率在我区(新疆)呈逐年上升趋势，严重影响了马产业的发展。因此，为了综合防治该病在我区发生和流行，必先建立特异性强、检出率高的诊断方法及时进行检疫马，故马驽巴贝斯虫病荧光PCR快速检测试剂盒的研制是我区兽医工作者努力研究、亟待解决的新课题之一。目前，对马驽巴贝斯虫病诊断方法大致可分为病原体显微镜检测方法、血清学诊断方法和分子生物学技术诊断方法。基层疫病监测部门该病的诊断仍停留在传统的镜检法，且受到制片与染色技术等多种因素的影响，易造成漏诊和误诊，特别是相似形态虫体的鉴别诊断以及大规模的流行病学调查较为困难。常规血清学诊断方法存在着抗原来源不足、敏感性和特异性较差等问题，且马驽巴贝斯虫体外培养尚未成功。所以在我区，每年的3～7月份，大量马因马驽巴贝斯虫病死亡，故唯一可行的，是借鉴流行病学研究，创建实用、简便、经济、灵敏度高的新诊断体系。荧光PCR检测技术作为一种较新的检测方法，尤其是目前在动物疾病研究领域应用十分广泛。与普通PCR技术相比较，实时荧光定量PCR技术的优势十分显著：操作简便，无需在扩增后进行凝胶电泳成像；由于省去了开盖后出现的二次污染，使得该技术出现假阳性的几率大大降低；通过计算机系统的介入，该方法可以对扩增过程进行实时定量监控，可对扩增产物进行准确的定量分析。荧光定量PCR原理是将荧光物质或具有荧光信号的特异性探针通过与靶基因的特异性结合，仪器实时监控每一个封闭的PCR反应，系统软件根据荧光信号的强弱自动绘制反应曲线，从而对整个PCR反应过程的荧光信号的增减进行实时监测。在荧光定量PCR技术中，值得了解的是Ct值，其中的C所代表的含义为Cycle，t所代表的含义为threshold，表示每个扩增反应达到阈值时所经历的循环数，每个样本的初始拷贝数与Ct值成线性相关，所以当Ct值很小时，就表示起始拷贝数很多。因此，当我们利用确定的标准品即可绘制出该标准品的标准曲线，由于特异性探针的所发出的报告基团荧光强度与PCR扩增产物数量表现为线性相关，当获知待测样本的Ct值后，就可从根据标准曲线计算出该样品的起始拷贝数，实现定量分析。近年来，马驽巴贝斯虫诊断技术逐步创新，从最早的显微镜观察虫体到现在的应用分子生物学手段检测马驽巴贝斯虫。1993年我国孔凡勇对马梨形虫病进行了马梨形虫病病原体显微镜检测。Camacho等(2005)对60匹马进行IFAT检测，马驽巴贝斯虫阳性率为28.3％。Kappmeyer等(1999)建立了马驽巴贝斯虫棒状蛋白重组抗原ELISA方法，cELISA方法的阳性率达49.5％。YohTamaki等(2003)应用Babesiacaballi棒状蛋白克隆并表达了重组蛋白BC134，可用于ELISA检测。Bashiruddin等(1999)建立了PCR检测方法，该试验对23份葡萄牙马匹进行了检测，结果表明发病率为34.8％。Badgar等(2001)对传播马梨形虫病的媒介蜱虫感染马梨形虫病应用PCR方法进行检测，结果表明54个样品中马驽巴贝虫染病率达到12.9％。Alhassan(2005)根据18SrRNA基因序列设计出了能够同时检测两种病的双重PCR方法。薛书江等(2007)利用马驽巴贝斯虫Bc48基因序列设计、合成特异性引物，建立了马驽巴贝斯虫病PCR检测方法，对35份采集样本进行检测发现阳性率为20％。Pitel等(2010)提取35匹患马梨形虫病却没有明显临床病症的马匹骨髓进行PCR扩增以检测是否感染马梨形虫病，检测结果显示普通PCR检测与在显微镜下检测符合率达100％。从血液涂片镜检到现在的PCR诊断技术，马驽巴贝斯虫病的检测技术正在逐步发展创新。在前期工作基础上，我们分离地方虫株(新疆虫株)，对其Bc-48基因克隆、表达。在上述基础，我们在引物、探针的设计、试剂用量、体系建立、条件的优化及配套组装试剂盒等方面进行探讨，最终研发了马驽巴贝斯虫病荧光PCR诊断试剂盒。用其快速、特异、价廉的诊断试剂，进行检测和防控马驽巴贝斯虫病，从而净化马群，根除该病对养马业的危害，保障畜牧业的健康发展。
技术实现思路
本专利技术的目的：本专利技术的目的是提供一种马驽巴贝斯虫快速诊断技术及试剂盒解决常规检测试剂盒昂贵、特异性差、耗时等缺点。为解决现阶段马驽巴贝斯虫检测本专利技术通过设计检测引物和荧光探针，结合荧光定量PCR系统绝对定量分析，通过优化反应体系和循环条件，建立马驽巴贝斯虫病荧光PCR检测方法。并建立一种基于荧光定量PCR标量的马驽巴贝斯虫病荧光PCR检测试剂盒，适用于马驽巴贝斯虫病的临床诊断和流行病学监测。本专利技术的技术方案如下：一种用于检测马驽巴贝斯虫病(Babesiacaballi)的遗传标记物，其具有SEQIDNO.4所示的序列或其特异性片段。用于扩增上述遗传标记物的特异性引物对，其核苷酸序列为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示：上游引物：5’-CGCATTTGCAGTCAGGTCC-3’下游引物：5’-ACTGGTAGGGCTCAGGAAGG-3’。与上述的引物配合使用的荧光探针，其核苷酸序列为SEQIDNo.3所示：5’-AGGGGAGTAACTGCAGTGCTTCCGT-3’。一种检测马驽巴贝斯虫病的试剂盒，含有上述特异性引物对和上述荧光探针。还包括荧光定量PCR反应试剂，阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为马驽巴贝斯虫病的标准阳性模板，阴性对照品为灭菌去离子水。上述试剂盒，采用荧光PCR方法进行检测，制定标准阳性模板，其25μL反应体系为：试剂盒中的引物、探针荧光PCR工作程序为：95℃预变性5min，1个循环；95℃变性15s，60℃变性45s，40次循环。上述试剂盒采用荧光定量PCR方法进行检测，优化后的荧光定量PCR反应体系为25μL：将上述的特异性引物对和荧光探针在制备检测马驽巴贝斯虫病试剂盒中的应用。实现方式，专利技术人下载GenBank数据库中已报道的不同国家和地区的马驽巴贝斯虫Bc-48基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测马驽巴贝斯虫病(Babesia caballi)的遗传标记物，其具有SEQ ID No.4所示的序列或其特异性片段。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测马驽巴贝斯虫病(Babesiacaballi)的遗传标记物，其具有SEQID
No.4所示的序列或其特异性片段。
2.用于扩增权利要求1所述遗传标记物的特异性引物对，其核苷酸序列为SEQIDNo.1
和SEQIDNo.2所示：
上游引物：5’-CGCATTTGCAGTCAGGTCC-3’
下游引物：5’-ACTGGTAGGGCTCAGGAAGG-3’。
3.与权利要求2所述的引物配合使用的荧光探针，其核苷酸序列为SEQIDNo.3所示：
5’-AGGGGAGTAACTGCAGTGCTTCCGT-3’。
4.一种检测马驽巴贝斯虫病的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的特异性引物
对和权利要求3所述的荧光探针。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：巴音查汗·盖力克，张杨，李永畅，王振宝，宋瑞其，明·乌尔娜，王美玲，
申请(专利权)人：新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65