一种从银鲳中分离的具有抗菌性能的多肽制造技术

本发明专利技术提供一种从银鲳中分离的具有抗菌性能的多肽，该多肽的序列为SEQ ID NO:2；编码上述多肽的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明专利技术所提供的抗菌肽对水产领域中常见的病害菌具有明显的抗性，可用作银鲳的饲料添加剂来使用。

【技术实现步骤摘要】
一种从银鲳中分离的具有抗菌性能的多肽
本专利技术提供一种从银鲳中分离的抗菌多肽，属于功能性多肽筛选领域。
技术介绍
银鲳(Pampusargenteus)隶属于鲈形目(Perciformes)、鲳科(Stromateidae)、鲳属(Pampus)，不仅是我国沿海主要的经济鱼类之一，而且在印度、科威特、伊朗等国家的渔业经济中也占了较大的比重。近20年来，由于过度捕捞和环境污染，野生银鲳资源不断萎缩，因此，开展银鲳人工养殖和育苗就显得尤为重要。但由于银鲳幼鱼对外部干扰应激强烈，人工养殖管理工作中的换水、分池和捕捞等操作极易引起鱼体机械损伤，最后导致免疫力下降或感染其他疾病而死亡，这使得银鲳的人工养殖和育苗很难顺利进行。抗生素作为一种对病原菌疗效显著的药物在临床上广泛应用。但随着抗生素的长期使用，大量耐药性菌株不断产生而导致抗生素疗效下降、剂量提高，同时抗生素的滥用情况不断加剧等问题也引起了人们的重视。鉴于新药开发的速度较慢，因此抗菌肽作为一种新型的抗生素替代物就成为了研究热点。抗菌肽是从昆虫、被囊动物、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物、植物乃至人等多种生物体内组织和细胞中提取出的具有一定免疫作用的小分子类物质，又被称做肽抗生素(peptideantibiotics)或抗微生物肽(antimicrobialpeptides)。其独特的氨基酸组成及结构中的两亲性和阳离子特点使多肽可以和细胞核内大分子如核酸、蛋白质等，以及病毒或细菌表面带负电荷的成分相结合，进而破坏细胞膜结构或胞内大分子而扰乱细胞的正常功能并导致细胞死亡。在水产领域中，抗菌肽常被用作饲料添加剂来使用。但外源的抗菌肽常会因为生物不相容性使饲喂的动物产生应激反应；使养殖动物出现生长率降低等问题。因此，有必要筛选养殖动物自身来源的抗菌多肽，并对其结构、功能和作用机理进行分析就具有现实的研究意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种从银鲳中分离的具有抗菌性能的多肽，该多肽能用于银鲳的养殖领域。本专利技术所提供的多肽，其氨基酸序列为SEQIDNO:2；编码上述多肽的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:1；本专利技术的多肽用于制备抗菌制品；所述的抗菌制品为饲料添加剂；所述的饲料添加剂，为银鲳的人工饲料；所述的抗菌制品，还可以是其它水产领域常用的干粉或液体抗菌制品。本专利技术所提供的抗菌肽对水产领域中常见的病害菌具有明显的抗性，可用作银鲳的饲料添加剂来使用。附图说明图1：多肽PA1-1的抗菌肽数据库的序列比对图；图2：酵母转化子的鉴定图，其中M为marker，1为含酵母空载体的转化子，2为含重组表达载体的转化子；图3：纯化后的蛋白电泳图；其中M为marker；1为发酵上清液；2为纯化后的重组多肽；图4：菌株的存活率图。具体实施方式申请人通过分析本实验室所构建的银鲳cDNA文库，获得了本专利技术所提供的多肽，从而促成了本专利技术。现在通过具体实施例对本专利技术进行详细的描述实施例1：抗菌肽的筛选及检测考虑到天然抗菌肽通常是由小于50个氨基酸残基组成的多肽,分子量约为2000-5000道尔顿。因此，选择银鲳cDNA文库中择片段大小为200bp以下的核苷酸,将其翻译的氨基酸序列输入到抗菌肽数据库(antimicrobialpeptidedatabase,APD)进行相关分析，对相似度高于30％的核苷酸片段进行进一步的抗菌性分析。最终获得的5条相似度满足要求的多肽，其中一条多肽pa1-1的核苷酸序列如下：TCGCAGGGCGTGAAGCCCTCTATAAACGTTGGCTCGTATAGTCTGGCCACAATAATCCAGGATCTACTC(SEQIDNO:1)，其编码氨基酸序列为SQGVKPSINVGSYSLATIIQDLL(SEQIDNO:2)。其在抗菌肽数据库(antimicrobialpeptidedatabase,APD)中与编号为AP02053的抗菌肽的相似度最高，为40.74％(图1)，表明其为从银鲳中分离的新型多肽。实施例2：多肽pa1-1的重组表达使用毕赤酵母GS115菌株来重组表达pa1-1多肽，具体步骤如下：1)将PA1-1多肽的核苷酸序列(SEQIDNO:1)连接入毕赤酵母表达载体中。将含抗菌肽基因的载体和酵母表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定(图2)。2)阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后均匀涂布于含100μg/mLZeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3-5天。待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。3)将筛选到的阳性重组菌的单菌落活化后按1％-10％接种量接种于三角瓶，28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5％-20％接种量接入发酵罐中，温度28-30℃，转速500-1500r/min，培养基pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM，溶氧>20％情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50％甘油4h，待溶氧突然升至100％时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h。4)发酵结束后100℃灭菌10-20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为抗菌肽上清液；5)取诱导表达72h的发酵上清，经0.22μm滤膜过滤，通过SP-Sepharose阳离子交换层析进行纯化，用20mmol/L的pH6.5的磷酸钠缓冲液平衡层析柱，流速为1.0mL/min。待柱体平衡好后进行上样，之后用20mmol/L磷酸钠缓冲液冲洗柱子，然后用1.0mol/LNaCl进行梯度洗脱，并收集洗脱峰。电泳结果表明纯化后的重组蛋白为一条带(图3)，通过Folin酚法测定蛋白质浓度。实施例3：PA1-1多肽的抗菌性通过微量肉汤稀释法检测PA1-1多肽对大肠杆菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的抗菌性能。将纯化后的PA1-1重组蛋白通过PBS溶液进行透析后，冷冻干燥成粉，再用预冷的PBS溶解纯化的重组蛋白粉，采用Folin酚法测其浓度后，用PBS溶液调整浓度为1.5mg/Ml,作为重组PA1-1多肽溶液备用。选择大肠杆菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，取30μL活化的各菌液分别接种于10ml的LB液体培养基中，培养至OD600为0.5(约1×108CFU/mL)，用LB液体培养基稀释至3×105CFU/mL，分别吸取50μL稀释菌液至96孔培养板中，每孔加入50μL的多肽溶液，然后再37℃培养24h，每个菌株的阴性对照组各菌液中加入50μLPBS溶液。测定各处理组和对照组在OD600的吸光值，计算存活细胞率。结果显示，PA1-1多肽对大肠杆菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌均有很好的抑制效(图4)。最小抑菌浓度(MIC)的检测1)平板划线法获得大肠杆菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的纯化单菌落；然后分别挑选于10ml液体LB培养基中扩大培养至对数期，然后分别将培养后的菌液稀释成浓度为6×本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有抗菌活性的多肽，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

【技术特征摘要】
1.一种具有抗菌活性的多肽，所述的多肽的氨基酸序列为SEQIDNO:2。2.编码权利要求1所述的多肽的核酸片段。3.如权利要求2所述的核酸片段，其特征在于，所述的核酸片段的序列为SEQIDNO:1。4.权利要求1所述的多肽在制备抗菌制品中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗菌制...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡思雯，王亚军，胡佳宝，余娜，曹小欢，张曼，李渊博，郑俊勇，陶顺顺，徐芳君，
申请(专利权)人：宁波大学，象山港湾水产苗种有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33