一种从银鲳中分离的多肽制造技术

本发明专利技术提供一种从银鲳中分离的具有抗菌性能的多肽，该多肽的序列为SEQ ID NO:1；编码上述多肽的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明专利技术所提供的抗菌肽对水产领域中常见的病害菌具有明显的抗性，可用作银鲳的饲料添加剂来使用。

A polypeptide isolated from pomfret in

The present invention provides a polypeptide with antimicrobial properties isolated from pomfret in the sequence of the polypeptide is SEQ ID NO:1; encoding the polypeptide gene, the nucleotide sequence of SEQ ID NO:2. The antibacterial peptide provided by the invention has obvious resistance to disease in the field of aquatic bacterium, can be used as feed additives to the use of silver pomfret.

【技术实现步骤摘要】
一种从银鲳中分离的多肽
本专利技术提供一种从银鲳中分离的抗菌多肽，属于功能性多肽筛选领域。
技术介绍
银鲳(Pampusargenteus)隶属鲈形目(Perciformes)，鲳亚目(Stromateoidei)，鲳科(Stromateidae)，鲳属(Pampus)，俗称“车片鱼”、“叉扁鱼”(江浙地区)、“镜鱼”、“平鱼”(河北、山东)、“白鲳”(台湾、福建、广东)。体呈卵圆形，侧扁，口小，被小圆鳞，全身具银色光泽，一般在水深30～70米的水域集群栖息。我国沿海皆产，以东海资源量最高。东海银鲳肉厚、刺少、味佳，营养丰富，有较高的经济价值。过去银鲳的年渔获量曾达到近40万吨，然而进入上世纪90年代以后，由于过度捕捞其资源量出现明显下降，海洋捕捞产量长期维持零增长，加之海洋环境逐年恶化，银鲳资源衰退更为迅速。为了利用和保护这一重要的鱼种，近三十年来国内外学者们对银鲳开展了众多的研究。但对于银鲳的人工养殖和繁育研究国内起步较晚，直到2000年以后，施兆鸿、彭士明、徐善良等人开始了对银鲳人工养殖和繁育的探索。近几年宁波大学和东海水产研究所两家科研院所先后开展了小规模工厂化养殖试验。经过不断的努力已初步克服了银鲳的饵料营养、越冬与度夏、亲鱼培育等关键技术问题，并于2011年取得重大突破，采用温度、光照综合诱导方法调控银鲳性腺发育成熟，使人工养殖的银鲳亲鱼达到自行产卵，获得了批量受精卵。2015年5月又在国内首次实现了全人工子一代规模化繁育，育苗成活率得到提高。但目前有关银鲳亲鱼性腺发育及产卵调控技术尚不稳定，易受病害、营养、水质等条件影响。因此，病害防治作为银鲳养殖的一个重要环节以提上了研究日程。在水产养殖病害防治
中，抗生素作为一种对病原菌疗效显著的药物一直得到广泛应用。但随着抗生素的长期使用，大量耐药性菌株不断产生而导致抗生素疗效下降、剂量提高，同时抗生素的滥用情况不断加剧等问题也引起了人们的重视。鉴于新药开发的速度较慢，因此抗菌肽作为一种新型的抗生素替代物就成为了研究热点。抗菌肽是从昆虫、被囊动物、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物、植物乃至人等多种生物体内组织和细胞中提取出的具有一定免疫作用的小分子类物质，又被称做肽抗生素(peptideantibiotics)或抗微生物肽(antimicrobialpeptides)。其独特的氨基酸组成及结构中的两亲性和阳离子特点使多肽可以和细胞核内大分子如核酸、蛋白质等，以及病毒或细菌表面带负电荷的成分相结合，进而破坏细胞膜结构或胞内大分子而扰乱细胞的正常功能并导致细胞死亡。在水产领域中，抗菌肽常被用作饲料添加剂来使用。但外源的抗菌肽常会因为生物不相容性使饲喂的动物产生应激反应；使养殖动物出现生长率降低等问题。因此，有必要筛选养殖动物自身来源的抗菌多肽，并对其结构、功能和作用机理进行分析就具有现实研究意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种从银鲳中分离的多肽，该多肽具有良好的抗菌效果，从而弥补现有技术的不足。本专利技术所提供的具有抗菌活性的多肽，其氨基酸序列为SEQIDNO:2；编码上述多肽的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:1；本专利技术的多肽用于制备抑制细菌生长的制品；所述的细菌，优选为革兰氏阴性菌；所述的抑菌制品为饲料添加剂；所述的饲料添加剂，为银鲳的人工饲料添加剂。本专利技术所提供的多肽对水产领域中常见的病害细菌具有明显的抗性，可用作银鲳的饲料添加剂来使用。附图说明图1：多肽PA1-1的抗菌肽数据库的序列比对图；图2：微量肉汤稀释法的96孔板的实验图。具体实施方式现在通过具体实施例对本专利技术进行详细的描述实施例1：抗菌肽的筛选及检测通过向银鲳进行腹腔注射细菌进行免疫,分别提取实验组和对照组的肝脏组织，进行抑制性消减杂交后获得差异表达基因的文库。考虑到天然抗菌肽通常是由小于50个氨基酸残基组成的多肽,分子量约为2000-5000道尔顿。因此，从银鲳抑制性消减杂交后获得的cDNA文库中选择片段大小为200bp或以下的cDNA片段,将其编码的多肽的氨基酸序列输入到抗菌肽数据库(antimicrobialpeptidedatabase,APD)进行相关分析，对相似度高于30％的核苷酸片段进行进一步的抗菌性分析。最终获得的5条相似度满足要求的多肽，其中一条多肽命名为PA-3，其氨基酸序列为LLNRYYLLNFRRRHYPLSPCTYSNCLC(SEQIDNO:1)；编码上述多肽的核苷酸片段，其序列如下：CTGCTTAACCGGTACTATCTTCTCAACTTCCGACGTAGGCATTATCCACTGTCTCCCTGTACCTACTCTAATTGCCTGTGC(SEQIDNO:2)，对PA-3多肽进行检索，其在抗菌肽数据库(antimicrobialpeptidedatabase,APD，http://aps.unmc.edu/AP/main.php)中与编号为AP00078的抗菌肽的相似度最高，为32.43％(图1)，表明其为从银鲳中分离的新型多肽。PA-3多肽的氨基酸残基共有27个，具体如下：L-L-N-R-Y-Y-L-L-N-F-R-R-R-H-Y-P-L-S-P-C-T-Y-S-N-C-L-C；其中下划线为疏水性氨基酸，可以看出本专利技术多肽的N端和C端都是疏水性残基。抗菌肽可以形成一系列的二级结构，在这些二级结构的形成中，抗菌肽的疏水性氨基酸起了重要作用。疏水性使水溶性的抗菌肽能够穿过细胞双分子层，这种疏水相互作用在抗菌肽穿透生物膜的过程中起重要作用。其次，本专利技术的多肽中并不存在负电荷氨基酸，而具有5个正电荷氨基酸。一般来说正电荷较多的阳离子抗菌肽活力高于正电荷较少的抗菌肽；通过提高正电荷数目而使抗菌肽活性增强，同时也发现当减少正电荷时会导致抗菌肽失活。因此，申请人推测该多肽相比于其它筛选的多肽具有更好的抗菌性能。通过商业公司进行多肽的合成，合成的多肽的N末端添加乙酰基，C末端添加酰胺基。合成的多肽的纯度为95％以上，能够用于生物活性检测。实施例2：微量肉汤稀释法检测PA-3多肽的抗菌性使用微量肉汤稀释法检测PA-3多肽的抗菌性，根据文献(钱云霞等，海水养殖鱼类细菌性疾病研究概况，海洋湖沼通报，2001第二期，78-87)的记载来选择待检测的细菌。其中弧菌病的致病菌选用鳗弧菌；腹水病选用迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)，链球菌症选用金黄色葡萄球菌；以及杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)；同时检测多肽对诺卡氏菌(Nocardiakampachi)和大肠杆菌(Escherichiacoli)进行抗菌性的检测。其中大肠杆菌、鳗弧菌、迟缓爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌为革兰氏阴性菌；而金黄色葡萄球菌、诺卡氏菌为革兰氏阳性菌。使用微量肉汤稀释法检测PA-3多肽的抗菌性，其具体步骤如下：一、待测菌悬液的制备：1)菌液培养：分别取各待测菌的种子液10μL加入10mLMH肉汤培养基中，置37℃温箱过夜静止培养24小时左右；2)OD600值测定：利用紫外分光光度仪测定OD值，MH肉汤调整菌液浓度使其OD600值落在0.08-0.1之间(菌液浓度约1×108cfu/mL)；3)稀释获得待测菌悬液：将培养的菌液再进行稀释，使菌液浓度为1×105cf本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有抗菌活性的多肽，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

【技术特征摘要】
1.一种具有抗菌活性的多肽，所述的多肽的氨基酸序列为SEQIDNO:2。2.编码权利要求1所述的多肽的核酸片段。3.如权利要求2所述的核酸片段，其特征在于，所述的核酸片段的序列为SEQIDNO:1。4.权利要求1所述的多肽在制备抑菌制品...

【专利技术属性】
技术研发人员：张曼，王亚军，胡佳宝，余娜，匡思雯，曹小欢，乐琪君，郑俊勇，李渊博，陶顺顺，
申请(专利权)人：宁波大学，象山港湾水产苗种有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33