本发明专利技术公开一种可区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的引物及检测试剂盒。本发明专利技术的引物序列和试剂盒内的引物分别为：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2 、SEQ ID No.4、 SEQ ID No.5的引物和探针引物 SEQ ID No.3和SEQ ID No.6。使用本发明专利技术进行检测具有灵敏度高、速度快、特异性强等优点，可在病原体的定性和定量检测方面得到了广泛应用。
【技术实现步骤摘要】
区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的引物及试剂盒
本专利技术涉及一种检测动物寄生虫的引物对及试剂盒。确切讲，本专利技术涉及一种可区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的引物及检测试剂盒。
技术介绍
现已报道的巴贝斯虫有100多个种，其中命名并被公认感染羊的巴贝斯虫有绵羊巴贝斯虫（B.ovis）、莫氏巴贝斯虫（B.motasi）、粗糙巴贝斯虫（B.crassi）和一些巴贝斯虫未定种。绵羊巴贝斯虫由扇头蜱属（Rhipicephalus）的硬蜱传播，是强致病性的小型巴贝斯虫，其生物学特性与牛巴贝斯虫基本一致；粗糙巴贝斯虫是一种致病力低的大型巴贝斯虫，以四分裂或二分裂的方式进行繁殖，其传播媒介蜱和传播方式尚不清楚，目前仅在伊朗和土耳其发现；而莫氏巴贝斯虫是感染羊的巴贝斯虫中分布最为广泛、分类特征最为复杂的虫体，其致病性因其分布的不同而不同，如在南欧和地中海沿岸分离的具有较强的致病性，而在北欧分离的致病性较弱，且这两种莫氏巴贝斯虫均是由刻点血蜱（Haemaphysalispunctata）传播的大型巴贝斯虫，在非洲撒哈拉沙漠分离的莫氏巴贝斯虫，形态上介于已知的莫氏巴贝斯虫和绵羊巴贝斯虫之间，但其传播媒介不是血蜱属的蜱。依据巴贝斯虫的致病性、对绵羊和山羊感染力的差异、形态学、血清学和分子分类进化关系分析结果，Uilenberg(2006)认为莫氏巴贝斯虫中至少含有两个或两个以上的种或亚种。我国在1996年以前，只有2-3例羊巴贝斯虫病的报道，而后分别在甘肃、河北、辽宁、云南、山西、河南和新疆等地出现发病的报道。本病的流行范围呈逐年扩大趋势，可能与媒介蜱分布范围的广泛有一定关系。本研究团队于上世纪末开始，对我国部分省区羊巴贝斯虫病的发生进行了选点调查。通过血液接种和蜱传播实验，先后在我国辽宁、河北、甘肃、湖北、新疆等地分离获得了9株羊的巴贝斯虫地方株。流行病学调查发现该病在我国流行广泛，一些地方危害严重，阳性率在30%以上，病原对外地引进的良种羊和羔羊致病性较强，严重制约羊的品种改良和养羊业的发展。以梨形虫（包括巴贝斯虫和泰勒虫）的核糖体18SrRNA基因进行分子分类研究发现，甘肃临潭、麻当、天祝和宁县以及河北、湖北和辽宁的分离株均与莫氏巴贝斯虫有较近的亲缘关系，所以定名为莫氏巴贝斯虫(Liuetal.,2007;Guanetal.,2009)，而以核糖体28SrRNA和转录间隔区ITS基因、线粒体CoI基因等进行分子分类的研究中发现:中国的莫氏巴贝斯虫又可分为两个亚支；一是低致病性的莫氏巴贝斯虫临潭株和莫氏巴贝斯虫天祝株，二是高致病性的莫氏巴贝斯虫宁县株和莫氏巴贝斯虫河北株(Niuetal.,2009a)。2010年，Guan等(Guanetal.,2010e)证实莫氏巴贝斯虫临潭株全虫抗原与莫氏巴贝斯虫天祝株感染绵羊的阳性血清有强烈的交叉反应，而与莫氏巴贝斯虫宁县株和河北株的阳性血清没有交叉反应。这些结果与Uilenberg的结论相符：中国的莫氏巴贝斯虫也可能至少存在两个不同的亚种。经传播实验证实，莫氏巴贝斯虫不同亚种之间的传播媒介也不相同，有些亚种的传播媒介目前尚未研究清楚。人的巴贝斯虫病最早报道于1960年，主要由两种感染人的巴贝斯虫病病原—田鼠巴贝斯虫（B.microti）和分歧巴贝斯虫(B.divergens)引起，患者常伴有严重贫血、间歇高热、肌肉酸痛、抽搐等并发各种综合症，严重感染时可引起死亡。近年的研究表明以前不感染人的巴贝斯虫，由于虫媒分布范围的不断广泛,携带人巴贝斯虫致病性病原的宿主范围也在扩大，新的人巴贝斯虫致病性病原在不断出现（SchnittgerL,etal.,2012），该病已逐步成为一种世界性的人类新发寄生虫病受到公众关注。据目前文献记载，现主要有四大类巴贝斯虫具有人兽共患的能力，第一类为田鼠巴贝斯虫，它是一种与啮齿类动物密切相关的人兽共患寄生虫，美国大部分人感染巴贝斯虫病例都是由其造成的；第二类为新命名的B.duncani，形态类似田鼠巴贝斯虫，但是二者亲缘关系较远；第三类包括分歧巴贝斯虫（B.divergence）和类分歧巴贝斯虫、B.venatorum（也被称为ＥＵ１）；第四类为韩国新发现的巴贝斯虫ＫＯ１型，与中国的莫氏巴贝斯虫河北株病原形态很相似，分子分类分析表明两者的同源性高达98%，且核苷酸序列只差13个碱基。现阶段，我国主要存在两个种的羊巴贝斯虫—莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种新疆株。然而莫氏巴贝斯虫不同地方分离株之间，由于其致病性、传播媒介和血清学存在一定差异，结合分子分类学表明莫氏巴贝斯虫存在两个不同的亚种，即低致病性的莫氏巴贝斯虫亚种，如临潭株和天祝株；高致病性的莫氏巴贝斯虫亚种，如宁县株和河北株。巴贝斯虫检测的金标准是采用血涂片染色镜检的方式，但血涂片染色镜检结果受到很多因素的影响，检出率低，准确性较差。常规PCR、套式PCR以及基于SYBRGreen染料的实时荧光PCR等核酸方法虽有应用，但常规PCR存在灵敏度低，特异性差，检测周期长等缺点；套式PCR灵敏度高，但两步的PCR反应繁琐、易污染，不适用于大规模的流行病学调查。
技术实现思路
本专利技术提供一种可克服现有技术不足，能区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的引物及试剂盒。本专利技术的区分检测低致病性莫氏巴贝虫的引物对基因序列为：SEQIDNo.1和SEQIDNo.2；区分检测高致病性莫氏巴贝虫的引物对基因序列为：SEQIDNo.4和SEQIDNo.5。本专利技术的区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的试剂盒内包括序列为：SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5的引物和探针引物SEQIDNo.3和SEQIDNo.6。为方便使用，本专利技术的区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的试剂盒内还有：标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-18SrRNABLT和pGEM-Teasy-18SrRNABNX。本专利技术的区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的试剂盒进行PCR扩增的条件是：用本专利技术的引物及试剂盒进行扩增的条件是：低致病性的莫氏巴贝斯虫PCR扩增的条件是：95℃预变性30s，然后95℃5s、58℃10s、72℃30s，40个循环；高致病性的莫氏巴贝斯虫PCR扩增的条件是：95℃预变性30s，然后95℃5s、60℃10s、72℃30s，40个循环。本专利技术在具体应用时建议应有如下三部分组成：1）特异性检测低致病性的莫氏巴贝斯虫亚种的标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-18SrRNABLT、正向引物SEQIDNo.1和反向引物SEQIDNo.2（10μΜ）各0.5μL，荧光探针SEQIDNo.3（5μM）1.0μL；2）特异性检测高致病性的莫氏巴贝斯虫亚种的标准阳性质粒模板pGEM-Teasy-18SrRNABNX、正向引物SEQIDNo.4和反向引物SEQIDNo.5（10μΜ）各0.5μL，荧光探针SEQIDNo.6（5μM）1.0μL；3）适用于两种检测方法的公用试剂荧光定量PCR反应液、阴性质控标准品。其中的荧光定量PCR反应液由PremixExTaqTM（2×）12.5μL，ROXReferenceDyeⅡ（50×）0.5μL，灭菌蒸馏水8.0μL。本专利技术是一种TaqMan实时荧光定本文档来自技高网...
【技术保护点】
区分检测低致病性莫氏巴贝虫的引物对，其特征在于引物对基因序列为：SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
【技术特征摘要】
1.区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的试剂盒，其特征在于试剂盒内包括序列为：SEQIDNo.1、SEQI...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘爱红，刘军龙，关贵全，谢俊仁，罗建勋，殷宏，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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