一种广谱灵活的检测人乳头瘤病毒基因型的方法技术

本发明专利技术提供一种广谱灵活的检测人乳头瘤病毒基因型的方法，检测型别涵盖国际肿瘤研究机构IARC所述致癌和致病的45个HPV基因型(亚型)和1个中国CDC新鉴定报道的引起巨大疣型,覆盖面超越了目前各种同类试剂盒涉及型别的总和。本发明专利技术以质谱扫描多重PCR为平台,将临床需求频率最高的21个致癌型和2个高发致疣型作为一个独立反应进行检测，总共仅需两个反应，最大程度地满足了临床重点检测和疑难病症广谱筛查的需求；检测组合灵活，性价比高；一天可以检测几个乃至几千个样本；自动实时报告结果,不受人为因素影响；能够一次同时准确检出数十种HPV型别。体现了高通量、高灵活性、高自动化和宽线性范围宽的独特优势,为致病HPV感染的全面普及筛查提供了不可或缺的检测工具。

【技术实现步骤摘要】
一种广谱灵活的检测人乳头瘤病毒基因型的方法
本专利技术涉及检测和鉴定病原微生物制剂领域，特别涉及一种广谱灵活的检测人乳头瘤病毒基因型的方法。
技术介绍
1983年德国病毒学家哈拉尔德·楚尔·豪森(HaraldzurHausen)首先发现人乳头瘤病毒(HPV)的一些型别与宫颈癌有关。该研究成果使宫颈癌成为目前唯一可以预防并早期发现,可以治愈的人类癌症。2003年世界卫生组织国际肿瘤研究机构(WHO_IARC)公布了由9个国家11个研究机构得出的分析报告，根据HPV不同型别与宫颈癌的关系，将被检出的30个HPV基因型分为三大类，其中15种致癌高危型：16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68，73，82(W13B/MM4亚型和IS39亚型)；3种可能致癌高危型：26，53，66；及12种低危型：6，11，40，42，43，44，54，61，70，72，81(CP8304)和CP6108。2009年WHO_IARC召集了16个国家的36位科学家对生物致癌物质进行了重新评估，并对引起宫颈癌的HPV基因型进行了相关性排序：第一位为HPV-16型，它的致癌危险性较其它任何一种高危型都更为严重，已知可在人体的某些部位引起癌症；第二位包括：18，31，33，35，39，45，51，52，56，58和59型，有充分证据引起宫颈癌；第三位为HPV-68型，为有限证据对人致癌和强机理证据致癌；第四位包括：26，53，66，67，70，73和82型，为有限证据导致宫颈癌；此外，根据系统发生树分类，对人类具有充分或有限证据致癌的型别还有：30,34,69,85和97型；最后，HPV-6和HPV-11型基于流行病学证据不足和无潜在致癌机理的基础上归类为不属于对人类致癌型。工作组专家亦同时提出：除了对上述引起宫颈癌的alpha属HPV高度关注外，还应对beta和gamma属的HPV作进一步研究。这些广泛传播的HPV基因型可能引起皮肤癌，特别是Beta属中HPV-5和HPV-8型为可能致癌型，有限证据表明对疣状表皮发育不良症患者可引起皮肤癌。HPV属于乳头多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳头瘤病毒属，是一类可感染表皮和粘膜鳞状上皮的小DNA病毒。其基因组为双链环状DNA，长约7900对碱基(bp)，含8个开放阅读框(openreadingframes，ORFs)，依功能不同分3个区:(1)早期区(earlyregion，E区):分别编码E1、E2、E4、E5、E6、E7等6个早期蛋白，参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和转化等功能。(2)晚期区(lateregion，L区):编码主要外壳蛋白L1和次要外壳蛋白L2。(3)非编码区(uncodingregion，UCR)或上游调控区(URR):含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV表达所必需的调控元件。美国食品和药品管理局(FDA)目前批准的检测方法有：QiagenHCII高危HPV检测和HCII低危HPV检测；CervistaHPV16/18检测和Cervista高危HPV检测(Hologics)。HCII是第二代杂交捕获法(HybridCaptureII)，1999年上市，可定性区分13种高危型(16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68)与5种低危型(6/11/42/43/44)，但不能分型。Cervista应用恒温酶DNA扩增和荧光发光判读法，2009年上市，可定性检测14种高危型(与HCII相比增加了66型)，除16/18可以另外检测，也不能具体分型。2011年FDA首次批准cobasHPV16/18分型检测，2014年罗氏公司补充申报31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66和68型，其方法总共可分型检测14个高危型，FDA批准用于宫颈癌一线初级筛查。此外，罗氏LinearArrayHPV基因分型法，采用PCR扩增靶向DNA和核酸杂交检测37个HPV基因型[6,11,16,18,26,31,33,35,39,40,42,45,51,52,53,54,55,56,58,59,61,62,64,66,67,68,69,70,71,72,73(MM9),81,82(MM4),83(MM7),84(MM8),IS39andCP6108，可以用于美国以外的国家。中国食品药品监督管理总局(CFDA)批准上市的检测HPV的国产试剂，主要基于两种方法：1、杂交法，包括达安19型、凯普21型、亚能23型、透景26型等方法，第二代杂交捕获法(HC2)等；2、实时荧光PCR法，包括之江13种高危分型，港龙、凯普、亚能等公司13种高危不分型、达安8个型定量等。此外，采用PCR-质谱联用技术检测HPV申报专利的方法有密执安州立大学和深圳华大基因。前者针对E6基因区进行13种高危型作分型和定量检测，后者采用通用GP5+/GP6+引物针对L1基因区分析17个型。中国医学科学院采用EL双基因探针检测2003年IARC公布的30个HPV基因型。上述方法存在的问题是：1.检测的HPV型别少，均未能达到国际肿瘤研究机构IARC在2003和2009年提出的对人类致癌或致病的总共46个HPV基因型，特别是均没有包括根据系统发生树分类，对人类具有充分或有限证据致癌的5个型别中的4个型(30,34,85,97)；也没有包括Beta属的2个致癌型(5,8)和中国CDC新鉴定出的引起巨大疣的型别(2)。无法满足当前临床对广谱筛查HPV的需求，其检测结果将使＞1％的人检测漏诊。2.采用杂交方法检测的灵敏度低，约为5000copies/ml，且需要目测，检测线性范围窄。经对比实验发现，目前一次可以检测20多个型的试剂盒，在实际检测中往往一次最多只能检出约3种高载量的基因型，而遗漏了高危低载量的型别，如HPV16型病毒在整合到人体基因组后，易产生强致癌性,但因L1基因丢失而易产生漏检。3.采用实时荧光PCR法的检测型别数量受限，型别数量最高的分型试剂盒仅为13个型别，且需要用5个反应完成检测。4.目前的PCR-质谱法采用多重PCR探针混合识别在同一个通用引物扩增区中的相似序列，易产生交叉错配的假阳性问题，导致结果难以重复。采用双基因探针法，检测30个基因型，需要同时用3个反应检测，且型别涵盖面亦不够全面。此外，因成本较高，超出常规临床检测收费标准的承受能力，主要适用于其它方法难以准确检测的石蜡样本。
技术实现思路
本专利技术提供了一种广谱灵活的检测人乳头瘤病毒基因型(亚型)分型的方法，旨在最大限度覆盖IARC提出的所有致癌和致病HPV基因型，以及中国CDC鉴定出的罕见型别；对确切高危致癌型HPV16采用E/L双基因探针，以使该病毒的漏检率降至最低；将所有21个高危致癌型和占85％以上的2个高发致疣型作为一个独立反应进行检测，总共46型仅需两个反应。最大程度地满足了临床重点检测和疑难病症广谱筛查的需求；检测组合灵活，性价比高；一天可以检测几个乃至几千个样本；自动实时报告结果,不受人为因素影响；能够一次同时准确检出数十种HPV型别。体现了高通量、高灵活性、高自动化和宽线性范围宽的独特优势,为致病HPV感染的全面普及筛查提供了不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测生物样品中病原体DNA的试剂盒，所述试剂盒中包含合成的多核苷酸试剂，所述多核苷酸为HPV基因型的特异基因序列的正向和反向引物序列SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.94；碱基延伸探针SEQ ID NO.97‑SEQ ID NO.144；以及DNA质控引物序列为SEQ IDNO.95和SEQ ID NO.96，探针序列SEQ ID NO.145。

【技术特征摘要】
1.一种检测生物样品中病原体DNA的试剂盒，所述试剂盒中包含合成的多核苷酸试剂，所述多核苷酸为HPV基因型的特异基因序列的正向和反向引物序列SEQIDNO.1-SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵宝慧，郭军华，
申请(专利权)人：赵宝慧，郭军华，
类型：发明
国别省市：北京;11