The invention discloses a method of hot pepper and tomato bacterial spot pathogen molecular typing, first published by multilocus sequence typing (MLST) method, technique of molecular typing of pepper and tomato bacterial spot pathogen, the method of extracting the pathogen gene group DNA, through 7 housekeeping genes screening, amplification, detection and sequencing. Multiple sequence alignment and analysis of sequencing results were carried out by DNAMAN software, and the sequence of strain (ST) was obtained. Online V3 program using eBURST sequence analysis, the 4 kinds of pathogenic bacteria effectively distinguish. 7 housekeeping gene combinations and amplified primers used in the sub - type technique were first adopted, and the PCR reaction system and conditions were optimized for self - optimization. The technology can be used in pepper and tomato bacterial spot pathogen identification and genetic diversity research.
【技术实现步骤摘要】
辣椒和番茄细菌性疮痂病菌MLST分子分型方法
本专利技术涉及植物病原菌分子分型技术,具体涉及用多位点序列分型(MLST)技术对辣椒和番茄细菌性疮痂病菌(BacterialSpotcausedbyXanthomonads)进行分型的方法。
技术介绍
辣椒和番茄疮痂病是普遍发生在茄科植物上的一种细菌性病害,该病菌主要危害辣椒和番茄的叶片、茎蔓、果实,尤以叶片上发生普遍。叶片发病初期形成水渍状、黄绿色的小斑点,扩大后变成圆形或不规则形、暗褐色、边缘隆起而中央凹陷的病斑,粗糙呈疮痂状。严重时叶片发黄、干枯、破裂,早期脱落。茎部和果梗发病,初期形成水渍状斑点,逐渐发展成褐色短条斑。病斑木栓化隆起,纵裂呈溃疡状疮痂斑。果实发病,形成圆形或长圆形的黑色疮痂斑。该病害如果防治不及时,不仅大幅降低辣椒和番茄的产量,而且还严重影响辣椒和番茄的果实品质,造成重大经济损失。目前该病菌已在美国、巴西、澳大利亚、南非、南斯拉夫、墨西哥、哥斯达黎加、阿根廷等全球60多个国家和地区发生,是世界性病害之一。在我国新疆、甘肃、内蒙古、黑龙江、北京、山西等十几个地区也有发生,已引起人们广泛的关注。早在20世纪60年代,Dye等(1964)就已经发现辣椒和番茄细菌性疮痂病病原菌存在相当丰富的遗传多样性。2004年Jones等将该病菌分成4个种:X.euvesicatoria、X.vesicatoria、X.perforans、X.gardneri。多位点序列分型(MLST)技术是直接利用5~10个看家基因的核苷酸序列片段之间的碱基差异进行分子分型的方法。看家基因是有保守代谢功能的基因,进化相对缓 ...
【技术保护点】
一种用于辣椒和番茄细菌性疮痂病菌分子分型的扩增引物对组合,其特征在于:所述扩增引物对组合中各引物对序列为:glnA1: TCATCTTCGATTCGGTGCGglnA2:AGGCGCTTGTAGCTGTTGGtrpB 1:CCATGTAGACCACGCATTCCAtrpB2: GCCCATCAGTGACTTTTACGCaroE1:CGCAGGTCTTCGATGTAACGCaroE2: CCTGTCGCCCATTCGCTGTgltA1: ACCTTGTGGGTCATCTCGCgltA2: GGCCGCCATCCGTTTGAleuA1:ACGACCGTATCCAACCAGACCleuA 2: TGGTGAAGCCGACCGTGTpetC 1: GAACAGGACCACCCATACGCpetC 2: CGGCTGCCATTCGTTGAadk1: GCCTTGCTGATGCGTTCCAadk2: CCCAGGCGACACGTCTCAA。
【技术特征摘要】
1.一种用于辣椒和番茄细菌性疮痂病菌分子分型的扩增引物对组合,其特征在于:所述扩增引物对组合中各引物对序列为:glnA1:TCATCTTCGATTCGGTGCGglnA2:AGGCGCTTGTAGCTGTTGGtrpB1:CCATGTAGACCACGCATTCCAtrpB2:GCCCATCAGTGACTTTTACGCaroE1:CGCAGGTCTTCGATGTAACGCaroE2:CCTGTCGCCCATTCGCTGTgltA1:ACCTTGTGGGTCATCTCGCgltA2:GGCCGCCATCCGTTTGAleuA1:ACGACCGTATCCAACCAGACCleuA2:TGGTGAAGCCGACCGTGTpetC1:GAACAGGACCACCCATACGCpetC2:CGGCTGCCATTCGTTGAadk1:GCCTTGCTGATGCGTTCCAadk2:CCCAGGCGACACGTCTCAA。2.一种利用权利要求1所述的引物对组合进行辣椒和番茄细菌性疮痂病菌分子分型的方法,其特征在于:该方法用所述引物对组合对样品进行PCR扩增,将扩增产物进行检测和测序,用软件进行序列比对,获得菌株序列型,在线采用eBURSTV3程序进行序列型分析,可将4种病原菌有效区分。3.如权利要求2所述的方法,其中PCR扩增的50μL反应体系如下:ddH2O36μl10×PCRbuffer(Mg2+)5μLdNTPs(2.5mM)4μLPrimer(+)(10μM)1μLPrimer(-)(10μM)1μLTaqDNA聚合酶(5U/μl)1μLDNA模板(10~50ng/μl)2μLPCR反应条件为:预变性温度95℃,5min;变性温度95℃,30s;退火温度60℃,30s;延伸温度72℃,30s;一共32个循环,最后延伸的温度是72℃,5min。4.如权利要求2所述的方法,其特征在于:该方法包括如下步骤:(1)细菌基因...
【专利技术属性】
技术研发人员:刘清波,赵廷昌,黄红梅,
申请(专利权)人:湖南农业大学,
类型:发明
国别省市:湖南,43
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