本发明专利技术公开了一种丙酮酸工业量产发酵工艺，该工艺包括光滑球拟酵母的平板培养、茄瓶培养、摇瓶培养、一级种子罐培养进而进行一百五十立方发酵罐进行工业化量产发酵工艺及培养基具体构成成分及比例；该工艺填补了丙酮酸工业量产发酵尤其适用于一百五十立方的大型发酵罐进行发酵生产的工艺空白，不仅发酵周期缩短至56h，产率也同样是获得较高收益，并有效的解决了菌种对发酵液饱和丙酮酸的内耗和转化，保证了产品收益和质量。
【技术实现步骤摘要】
丙酮酸工业量产发酵工艺
本专利技术涉及微生物发酵
，尤其涉及一种适用于一百五十立方的大型发酵罐的丙酮酸工业量产发酵工艺。
技术介绍
丙酮酸作为重要的有机酸之一，又称2-氧化丙酸、α-酮基丙酸或乙酰基甲酸，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是合成多种有用化合物的前体，因此，它在制药、日用化工、农用化学品和食品等工业及科学研究中有着广泛的用途。目前，相对于化学合成法生产的丙酮酸，发酵法生产丙酮酸具有成本低、高质量的优点；近些年，针对发酵法发酵丙酮酸工艺的研究随之进行，研究多采用光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸；由于光滑球拟酵母属的多重维生素营养缺陷型菌株是目前发酵法生产中最常用的和最具有竞争力的生产菌株，因此，采用发酵法生产丙酮酸在菌种、发酵条件优化等方面作为研发重点。当前，针对光滑球拟酵母发酵生丙酮酸提供了如下参考文献：(1)、2003年第23期《精细与专用化学品》.光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸.刘立明等；(2)、《生物工程报》第16卷2期.营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响.2000.3.李寅等；(3)、2012年第31卷第4期《中国酿造》.光滑球拟酵母适应进化改善丙酮酸生产.赵博等；如上参考文献中存在一定的技术缺陷：第一、发酵周期较长、产率低；第二、针对发酵现实中出现的丙酮酸的降解或者转化问题，没有进行有效解决；第三、中试与大生产一百五十立方的大型发酵罐在发酵工艺参数的变化不同，工艺控制点的范围也不同，进而实现工业量产。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服现有技术的不足，提供了一种适用于一百五十立方的大型发酵罐的丙酮酸工业量产发酵工艺，该工艺发酵周期短、产率高、能较好抑制发酵过程中菌种对饱和的丙酮酸的降解或者转化问题。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：丙酮酸工业量产发酵工艺，具体工艺步骤如下：(1)平板培养：A.平板培养基(g/L)：葡糖糖浆3-4、大豆蛋白胨3-4、牛肉膏蛋白胨琼脂3-4、碳酸钙0.5-1、原水溶解，PH自然，121℃-124℃15min灭菌备用；B.光滑球拟酵母于平板培养基内，平板倒置培养皿中28℃-30℃培养，培养时间15h-20h后；(2)茄瓶培养：a.茄瓶培养基(g/L)：葡糖糖浆13-14、大豆蛋白胨11-12、牛肉膏蛋白胨琼脂10-12、碳酸钙2-2.5、氯化铵0.3-0.5、原水溶解，PH自然，121℃-124℃15min灭菌备用；b.在无菌室内严格按无菌操作，从保存平板上挑单菌落涂布在茄瓶固体培养基上；c.培养条件：28℃-30℃，培养时间15h-20h后；d.将茄瓶放置1℃-4℃的冰箱内存储备用；(3)种子摇瓶培养：I.摇瓶培养基(g/L)：葡糖糖浆17-18.5、大豆蛋白胨13.5-15.5、碳酸钙2.5-4.5、氯化铵0.5-0.8、氯化镁0.32-0.48、磷酸氢二钾0.2-0.4、原水溶解并用浓度为1.5mol/LHCL调节培养基初始PH为5-6，121℃-124℃15min灭菌备用；II.3000ml或5000ml的三角瓶或钢瓶二十至三十个，在无菌室内用灭过菌的接种铲，从培养好的茄瓶内铲取菌台接到500ml的三角瓶或钢瓶中；接种量为600ml/瓶-1000ml/瓶；培养温度为28℃-30℃，培养时间22h-24h；(4)一级种子培养：①一级种子培养基(g/L)：葡糖糖浆20-25、大豆蛋白胨16.5-18.5、碳酸钙6.5-8.5、氯化铵1.5-2.8、氯化镁1.32-3.48、磷酸氢二钾1.2-2.4、原水溶解并用浓度为1.5mol/LHCL调节培养基初始PH为5-6，121℃-124℃15min灭菌备用；②采用800L种子罐3-5个；种子摇瓶的合拼至三角钢瓶内，在无菌环境下对种子罐进行接种操作，接种量为2000ml/罐-3000ml/罐；③培养条件：培养温度28℃-30℃，1-6h通气量比1∶1，6h以后至种子成熟通气量比：1∶4，罐压维持在0.03MPa-0.05MPa；④种子成熟的标准：OD值在40-50之间；(5)发酵罐培养：第一.发酵培养基(g/L)：葡萄糖150-200、磷酸氢二钾5-10、氯化镁0.9-1.5、氯化铵8.5-9.5、碳酸钙20-25、醋酸钠6-8、消泡剂0.01-0.02、微量元素液3-5mL、维生素液3-5mL，PH用浓度为40mol/IHCL调至5.0-5.5，121℃-125℃连续灭菌；第二.培养条件：培养温度28℃-30℃，1-6h通气量比1∶1，搅拌转速100r/min-150min；6h-12h通气量比：1∶2，搅拌转速200r/min-350min；12h-30h通气量比：1∶3，搅拌转速400r/min-500min；30h以后通气量为1∶4，搅拌转速500r/min-700min；40h-56h搅拌转速800r/min-1000r/min；罐压维持在：0.03MPa-0.05MPa；进一步说明地是，所述微量元素液(g/L)：氯化锌3-6、氯化铁15-18、氯化铜0.2-0.3、氯化锰15-18，浓度为1.5mol/LHCL调节PH为5.0-5.5定容至1L-1.5L，121℃-125℃连续灭菌；进一步说明地是，所述维生素液(g/L)：维生素D0.03-0.04、维生素E0.003-0.005、维生素B10.2-0.3、维生素PP6-8，浓度为1.5mol/LHCL调节PH为5.0-5.5定容至1L-1.5L，121℃-125℃连续灭菌；进一步说明地是，所述发酵培养基的连消顺序：微量元素溶液、发酵培养基。进一步说明地是，所述一级种子培养中，④种子成熟的标准：波长660nm条件下的分光光度计，进行检测细胞浓度，成熟标准为：42-45进一步说明地是，所述发酵罐在发酵期间的PH环境采用浓度为8-10mol/LNaOH控制为5.0-5.5；进一步说明地是，所述种子成熟的标准的OD值高于50，进行二级种子培养；进一步说明地是，所述二级种子培养基(g/L)：i葡糖糖浆10-15、大豆蛋白胨13.5-15.5、碳酸钙3.5-5.5、氯化铵0.5-1.8、氯化镁0.32-1.48、磷酸氢二钾0.8-1.2、原水溶解并用浓度为1.5mol/LHCL调节培养基初始PH为5-6，121℃-124℃15min灭菌备用；ii采用800L种子罐；一级种子罐内种子液转入二级罐内进行再培养，接种量15L/罐-20L/罐；iii培养条件：培养温度28℃-30℃，1-6h通气量比1∶1，6h以后至种子成熟通气量比：1∶2，罐压维持在0.03MPa-0.05MPa；iv种子成熟的标准：OD值在80-120之间；v二级种子成熟后接入所述发酵培养基内进行发酵；需要更进一步说明地是，所述平板培养基(g/L)：葡糖糖浆2-6、大豆蛋白胨1-3、牛肉膏蛋白胨琼脂3-4、酵母膏1-3。需要再次说明地是，所述发酵培养基(g/L)：葡萄糖150-200、磷酸氢二钾5-10、氯化镁0.9-1.5、氯化铵8.5-9.5、氯化钙20-25、醋酸钠6-8、氯化钾2-3。需要再次说明地是：所述发酵过程中用浓度为60％的葡萄糖浆液对发酵罐进行补糖操作；所述补糖操作具体如本文档来自技高网...
【技术保护点】
丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述工艺包括以下步骤：(1)平板培养：A.平板培养基(g/L)：葡糖糖浆3‑4、大豆蛋白胨3‑4、牛肉膏蛋白胨琼脂3‑4、碳酸钙0.5‑1、原水溶解，PH自然，121℃‑124℃15min灭菌备用；B.光滑球拟酵母于平板培养基内，平板倒置培养皿中28℃‑30℃培养，培养时间15h‑20h后；(2)茄瓶培养：a.茄瓶培养基(g/L)：葡糖糖浆13‑14、大豆蛋白胨11‑12、牛肉膏蛋白胨琼脂10‑12、碳酸钙2‑2.5、氯化铵0.3‑0.5、原水溶解，PH自然，121℃‑124℃15min灭菌备用：b.在无菌室内严格按无菌操作，从保存平板上挑单菌落涂布在茄瓶固体培养基上；c.培养条件：28℃‑30℃，培养时间15h‑20h后；d.将茄瓶放置1℃‑4℃的冰箱内存储备用；(3)种子摇瓶培养：I.摇瓶培养基(g/L)：葡糖糖浆17‑18.5、大豆蛋白胨13.5‑15.5、碳酸钙2.5‑4.5、氯化铵0.5‑0.8、氯化镁0.32‑0.48、磷酸氢二钾0.2‑0.4、原水溶解并用浓度为1.5mol/L HCL调节培养基初始PH为5‑6，121℃‑124℃15min灭菌备用；II. 3000ml或5000ml的三角瓶或钢瓶二十至三十个，在无菌室内用灭过菌的接种铲，从培养好的茄瓶内铲取菌台接到500ml的三角瓶或钢瓶中；接种量为600ml/瓶‑1000ml/瓶；培养温度为28℃‑30℃，培养时间22h‑24h；(4)一级种子培养：①一级种子培养基(g/L)：葡糖糖浆20‑25、大豆蛋白胨16.5‑18.5、碳酸钙6.5‑8.5、氯化铵1.5‑2.8、氯化镁1.32‑3.48、磷酸氢二钾1.2‑2.4、原水溶解并用浓度为1.5mol/L HCL调节培养基初始PH为5‑6，121℃‑124℃15min灭菌备用；②采用800L种子罐3‑5个；种子摇瓶的合拼至三角钢瓶内，在无菌环境下对种子罐进行接种操作，接种量为2000ml/罐‑3000ml/罐；③培养条件：培养温度28℃‑30℃，1‑6h通气量比1∶1，6h以后至种子成熟通气量比：1∶4，罐压维持在0.03MPa‑0.05MPa；④种子成熟的标准：OD值在40‑50之间；(5)一百五十立方发酵罐培养：第一.发酵培养基(g/L)：葡萄糖150‑200、磷酸氢二钾5‑10、氯化镁0.9‑1.5、氯化铵8.5‑9.5、碳酸钙20‑25、醋酸钠6‑8、消泡剂0.01‑0.02、微量元素液3‑5mL、维生素液3‑5mL，PH用浓度为40mol/LHCL调至5.0‑5.5，121℃‑125℃连续灭菌；第二.培养条件：培养温度28℃‑30℃，1‑6h通气量比1∶1，搅拌转速100r/min‑150min；6h‑12h通气量比：1∶2，搅拌转速200r/min‑350min；12h‑30h通气量比：1∶3，搅拌转速400r/min‑500min；30h以后通气量为1∶4，搅拌转速500r/min‑700min；40h‑56h搅拌转速800r/min‑1000r/min；罐压维持在：0.03MPa‑0.05MPa。...
【技术特征摘要】
1.丙酮酸工业量产发酵工艺，其特征是，所述工艺包括以下步骤：(1)平板培养：A.平板培养基(g/L)：葡糖糖浆3-4、大豆蛋白胨3-4、牛肉膏蛋白胨琼脂3-4、碳酸钙0.5-1、原水溶解，PH自然，121℃-124℃15min灭菌备用；B.光滑球拟酵母于平板培养基内，平板倒置培养皿中28℃-30℃培养，培养时间15h-20h后；(2)茄瓶培养：a.茄瓶培养基(g/L)：葡糖糖浆13-14、大豆蛋白胨11-12、牛肉膏蛋白胨琼脂10-12、碳酸钙2-2.5、氯化铵0.3-0.5、原水溶解，PH自然，121℃-124℃15min灭菌备用：b.在无菌室内严格按无菌操作，从保存平板上挑单菌落涂布在茄瓶固体培养基上；c.培养条件：28℃-30℃，培养时间15h-20h后；d.将茄瓶放置1℃-4℃的冰箱内存储备用；(3)种子摇瓶培养：I.摇瓶培养基(g/L)：葡糖糖浆17-18.5、大豆蛋白胨13.5-15.5、碳酸钙2.5-4.5、氯化铵0.5-0.8、氯化镁0.32-0.48、磷酸氢二钾0.2-0.4、原水溶解并用浓度为1.5mol/LHCL调节培养基初始PH为5-6，121℃-124℃15min灭菌备用；II.3000ml或5000ml的三角瓶或钢瓶二十至三十个，在无菌室内用灭过菌的接种铲，从培养好的茄瓶内铲取菌台接到500ml的三角瓶或钢瓶中；接种量为600ml/瓶-1000ml/瓶；培养温度为28℃-30℃，培养时间22h-24h；(4)一级种子培养：①一级种子培养基(g/L)：葡糖糖浆20-25、大豆蛋白胨16.5-18.5、碳酸钙6.5-8.5、氯化铵1.5-2.8、氯化镁1.32-3.48、磷酸氢二钾1.2-2.4、原水溶解并用浓度为1.5mol/LHCL调节培养基初始PH为5-6，121℃-124℃15min灭菌备用；②采用800L种子罐3-5个；种子摇瓶的合拼至三角钢瓶内，在无菌环境下对种子罐进行接种操作，接种量为2000ml/罐-3000ml/罐；③培养条件：培养温度28℃-30℃，1-6h通气量比1∶1，6h以后至种子成熟通气量比：1∶4，罐压维持在0.03MPa-0.05MPa；④种子成熟的标准：OD值在40-50之间；(5)一百五十立方发酵罐培养：第一.发酵培养基(g/L)：葡萄糖150-200、磷酸氢二钾5-10、氯化镁0.9-1.5、氯化铵8.5-9.5、碳酸钙20-25、醋酸钠6-8、消泡剂0.01-0.02、微量元素液3-5mL、维生素液3-5mL，PH用浓度为40mol/LHCL调至5.0-5.5，121℃-125℃连续灭菌；第二.培养条件：培养温度28℃-30℃，1-6h通气量比1∶1，搅拌转速100r/min-150min；6h-12h通气量比：1∶2，搅拌转速200r/min-350min；12h-30h通气量比：1∶3，搅拌转速400r/min-500min；30h以后通气量为1∶4，搅拌转速500r/min-...
【专利技术属性】
技术研发人员：许友民，马辉，石光东，
申请(专利权)人：通辽市黄河龙生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15
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