小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，发酵工艺培养基碳源、氮源、硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、消泡剂，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0构成，并在发酵阶段无需调节发酵液的PH，同时采用了90％-95％(V/V)浓度的乙醇溶液提取发酵液；本工艺操作简单，适宜工业大生产，同时产品屈服性能YP值≥30。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵
，尤其涉及是一种小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺。
技术介绍
硬葡聚糖是通过小核菌发酵而得的非离子生物聚合物，又称小核菌多糖，该微生物多糖具有良好的增稠、悬浮、乳化性，其溶液粘度在PH值2-12基本保持不变，热稳定性好，适应温度高、耐高盐、抗氧化及抗酶解能力强。同时，其与酸、碱、盐、防腐剂、天然的或合成的增稠剂在同一溶液体系中具有良好的兼容性，还可以与卡拉胶、黄原胶、瓜尔胶、刺槐豆胶等复配。该生物聚合物被广泛应用于石油、化妆品、印染等行业。尤其在石油钻井的增稠性、堵漏及三次采用上应用量较大。随着国内外石油开采量的不断递增，对该生物聚合物的需求量日益增长。目前硬葡聚糖的主要生产厂家为法国SanofiIndustrie公司，现已被美国Cargill公司收购作为国外唯一对该生物聚合物进行量产的企业，国内乃至整个亚洲均没有发现对该微生物多糖进行工业量产的企业。因此，中国国内生物发酵企业研发并对该微生物多糖进行工业量产势在必行。当前，我们在研发和实现硬葡聚糖的工业量产上均与国内外企业及相关研究所进行了一定的技术探讨和交流发现：国内外现有技术及国内外公开的专利文献CN201110006769.0、CN201310283916.8、CN201410572695.0、CN201010605447.3和EP1417325A2中存在以下技术问题：(1)现有技术中，为维持培养基在发酵阶段的菌种适宜PH环境，均在发酵阶段对培养基的PH进行加碱维持PH值恒定，操作难度大。还常出现因加碱液过多导致PH值超高而抑制菌种生长，同时加碱操作时存在安全隐患，进而造成劳动强度大的不足。(2)随着石油开采地质的变化及钻井难度的增加，国内外石油企业对硬葡聚糖的屈服性能YP值提出了更高的要求，虽目前国内的检测标准中并没有对硬葡聚糖的屈服性能出台国标，但借鉴国外的检测标准对国内企业单位通过实验罐发酵获得的硬葡聚糖进行检测，目前现有技术中虽有检测硬葡聚糖的屈服性能YP值能够达到26.5-27，但无法实现更高要求(屈服性能YP值≥30)，因此这也是影响国内外石油企业对中国国内发酵企业生产硬葡聚糖的需求订单寥寥无几，进而无法刺激国内发酵企业实现对硬葡聚糖的大规模工业量产。(3)虽法国SanofiIndustrie公司(Cargill公司)作为国内外生产硬葡聚糖的主要企业，发酵时间长、培养基和提取工艺相对复杂，进而造成其生产的硬葡聚糖成本高，因此国际上硬葡聚糖的售价较高，国内企事业单位的现有技术中虽能将原来的发酵时间96h，缩短至现在的60h，但其因发酵周期缩短，检测时发现其产生的生物聚合物无法达到国内外石油企业更高要求的屈服性能YP值标准及热稳定性上大打折扣，产率不高，进而生产成本较高。同时我们还发现，Cargill公司在提取硬葡聚糖时，采用异丙醇进行提取，异丙醇在提取时易使盐类沉淀、气味难挥发，造成提取后的产物纯度低、异味、产物水粘度不高和提取成本高的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种更为优化的小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，该工艺实现了发酵过程不需要加碱液或其他碱性物质调节发酵液的PH环境，实现了发酵时间缩短和高产率的同时还提高了产品屈服性能YP值，提高了产品纯度，实现了产品无异味的目的。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，包括发酵和提取工艺，所述发酵工艺如下步骤：(1).菌种培养：菌种培养基的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0。将备有上述培养基的摇瓶置于温度为27℃-31℃摇床上，所述摇床转速100-140rpm，培养小核菌种子液，培养时间24h。(2).一级种子培养：一级种子培养基的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0。将上述培养基置入无菌的一级种子罐内，接着采用蒸汽对罐内培养基进行121℃-124℃的灭菌处理，灭菌时间30分钟-40分钟；降温至27℃-31℃后通过无菌接种管道将(1)中培养的小核菌种子液置入一级种子罐中培养；接种后的一级种子罐培养方法如下：培养时间0-10h，风量1-2m3/h。培养时间11-20h，风量2-3m3/h。培养时间20h以后，风量3-4m3/h。(3).二级种子培养：二级种子培养基的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0。将上述培养基置入无菌的二级种子罐内，接着采用蒸汽对罐内培养基进行121℃-124℃的灭菌处理，灭菌时间30分钟-40分钟；降温至27℃-31℃后通过无菌接种管道将(2)中培养的一级种子液置入二级种子罐中培养；接种后的二级种子罐培养方法如下：培养时间0-10h，风量2-3m3/h。培养时间11-20h，风量4-5m3/h。培养时间20h以后，风量8-10m3/h。(4).发酵罐发酵：发酵罐原料液的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0。将上述原料液通过UHT连续灭菌，温度121℃-124℃蒸汽喷射后注入发酵罐内，发酵料液体积是发酵罐体积的70％-75％，后通过循环冷却水对培养基进行降温至温度27℃-31℃，通过无菌接种管道将二级种子罐内培养的种子液置入发酵罐中发酵培养，二级种子液是所述发酵罐中的发酵料液的体积5-10％。接种后的发酵罐发酵方法如下：发酵时间0-10h，风量400-600m3/h，搅拌器电机转速600r/min。发酵时间11-30h，风量600-1000m3/h，搅拌器电机转速600-800r/min。发酵时间31h以后，风量1300-1500m3/h；搅拌器电机转速900-1100r/min。所述提取工艺步骤如下：第一步.发酵液前处理：将含有硬葡聚糖的发酵液90℃-100℃热处理5-10min，降温45℃-55℃并保温15min，并用20％-30％浓度的氢氧化钠溶液或20％-30％碳酸钠溶液将所述发酵液PH调至7.5-8.5；第二步.一次萃取：将处理后的发酵液与90％-95％(V/V)浓度的乙醇溶液按体积比1∶2混合，搅拌至出现絮状沉淀；第三步.一次离心：将一次萃取后的混合溶液固液分离，分理出纤维状硬葡聚糖；第四步.二次萃取：将上述纤维状硬葡聚糖与90％-95％(V/V)浓度的乙醇溶液混合搅拌清洗，乙醇加入量为一次萃取的二分之一；第五步.二次离心：将二次萃取后的混合溶液本文档来自技高网...

【技术保护点】
小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，包括发酵和提取工艺，其特征在于，所述发酵工艺如下步骤：(1).菌种培养：菌种培养基的组成及其质量百分比：碳源50‑100g/L、氮源5‑10g/L、硝酸钠0.5‑3g/L、磷酸二氢钾1.0‑2.0g/L、硫酸镁1.5‑2.5g/L、消泡剂0.1‑0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5‑6.0：将备有上述培养基的摇瓶置于温度为27℃‑31℃℃摇床上，所述摇床转速100‑140rpm，培养小核菌种子液，培养时间24h束。(2).一级种子培养：一级种子培养基的组成及其质量百分比：碳源50‑100g/L、氮源5‑10g/L、硝酸钠0.5‑3g/L、磷酸二氢钾1.0‑2.0g/L、硫酸镁1.5‑2.5g/L、消泡剂0.1‑0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5‑6.0。将上述培养基置入无菌的一级种子罐内，接着采用蒸汽对罐内培养基进行121℃‑124℃的灭菌处理，灭菌时间30分钟。降温至培养温度27℃‑31℃后通过无菌接种管道将(1)中培养的小核菌种子液置入一级种子罐中培养。接种后的一级种子罐培养方法如下：培养时间0‑10h，风量1‑2m3/h。培养时间11‑20h，风量2‑3m3/h。培养时间20h以后，风量3‑4m3/h。(3).二级种子培养：二级种子培养基的组成及其质量百分比：碳源50‑100g/L、氮源5‑10g/L、硝酸钠0.5‑3g/L、磷酸二氢钾1.0‑2.0g/L、硫酸镁1.5‑2.5g/L、消泡剂0.1‑0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5‑6.0。将上述培养基置入无菌的二级种子罐内，接着采用蒸汽对罐内培养基进行121℃‑124℃的灭菌处理，灭菌时间30分钟。降温至培养温度27℃‑31℃后通过无菌接种管道将(2)中培养的一级种子液置入二级种子罐中培养。接种后的二级种子罐培养方法如下：培养时间0‑10h，风量2‑3m3/h。培养时间11‑20h，风量4‑5m3/h。培养时间20h以后，风量8‑10m3/h。(4).发酵罐发酵：发酵培养基的组成及其质量百分比：碳源50‑100g/L、氮源5‑10g/L、硝酸钠0.5‑3g/L、磷酸二氢钾1.0‑2.0g/L、硫酸镁1.5‑2.5g/L、消泡剂0.1‑0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5‑6.0。将上述原料液通过UHT连续灭菌，温度121。℃‑124℃蒸汽喷射后注入发酵罐内，发酵料液体积是发酵罐体积的70％‑75％，后通过循环冷却水对发酵培养基进行降温至培养 温度27℃‑31℃，通过无菌接种管道将二级种子罐内培养的种子液置入发酵罐中发酵培养，二级种子液是所述发酵罐中的发酵料液的体积5‑10％。接种后的发酵罐工艺控制方法如下：发酵时间0‑10h，风量400‑600m3/h，搅拌器电机转速600r/min。发酵时间11‑30h，风量600‑1000m3/h，搅拌器电机转速600‑800r/min。发酵时间31h以后，风量1300‑1500m3/h；搅拌器电机转速900‑1100r/min。所述提取工艺步骤如下：第一步.发酵液预处理：将含有硬葡聚糖的发酵液90℃‑100℃热处理10min，降温至45℃‑55℃，并用30％浓度的氢氧化钠溶液或20％碳酸钠溶液将所述发酵液PH调至7.5‑8.5；第二步.一次萃取：将处理后的发酵液与90％‑95％(V/V)浓度的乙醇溶液按体积比1∶2混合，搅拌至出现絮状沉淀物；第三步.一次离心：将一次萃取后的混合溶液固液分离，分离出纤维状硬葡聚糖；第四步.二次萃取：将上述纤维状硬葡聚糖与90‑95％(V/V)浓度的乙醇溶液混合搅拌清洗，乙醇加入量为一次萃取的二分之一；第五步.二次离心：将二次萃取后的混合溶液固液分离，分离出纤维状硬葡聚糖；第六步.压榨：将分离出纤维状硬葡聚糖输入压榨机进行积压排出多余的乙醇，制得纤维状硬葡聚糖：第七步.干燥：将第六步中制得的固形物于真空干燥机中干燥，干燥温度60℃‑65℃，真空度为‑0.05‑‑0.08MPa，干燥时间100‑120分钟；第八步.磨粉：将干燥后的硬葡聚糖纤维用粉碎机磨粉，至产品完全通过80‑200目筛。...

【技术特征摘要】
1.小核菌硬葡聚糖工业量产发酵及提取工艺，包括发酵和提取工艺，其特征在于，所述发酵工艺如下步骤：(1).菌种培养：菌种培养基的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0：将备有上述培养基的摇瓶置于温度为27℃-31℃℃摇床上，所述摇床转速100-140rpm，培养小核菌种子液，培养时间24h束。(2).一级种子培养：一级种子培养基的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0。将上述培养基置入无菌的一级种子罐内，接着采用蒸汽对罐内培养基进行121℃-124℃的灭菌处理，灭菌时间30分钟。降温至培养温度27℃-31℃后通过无菌接种管道将(1)中培养的小核菌种子液置入一级种子罐中培养。接种后的一级种子罐培养方法如下：培养时间0-10h，风量1-2m3/h。培养时间11-20h，风量2-3m3/h。培养时间20h以后，风量3-4m3/h。(3).二级种子培养：二级种子培养基的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0。将上述培养基置入无菌的二级种子罐内，接着采用蒸汽对罐内培养基进行121℃-124℃的灭菌处理，灭菌时间30分钟。降温至培养温度27℃-31℃后通过无菌接种管道将(2)中培养的一级种子液置入二级种子罐中培养。接种后的二级种子罐培养方法如下：培养时间0-10h，风量2-3m3/h。培养时间11-20h，风量4-5m3/h。培养时间20h以后，风量8-10m3/h。(4).发酵罐发酵：发酵培养基的组成及其质量百分比：碳源50-100g/L、氮源5-10g/L、硝酸钠0.5-3g/L、磷酸二氢钾1.0-2.0g/L、硫酸镁1.5-2.5g/L、消泡剂0.1-0.5g/L，剩余为无菌水，PH＝4.5-6.0。将上述原料液通过UHT连续灭菌，温度121。℃-124℃蒸汽喷射后注入发酵罐内，发酵料液体积是发酵罐体积的70％-75％，后通过循环冷却水对发酵培养基进行降温至培养温度27℃-31℃，通过无菌接种管道将二级种子罐内培养的种子液置入发酵罐中发酵培养，二级种子液是所述发酵罐中的发酵料液的体积5-10％。接种后的发酵罐工艺控制方法如下：发酵时间0-10h，风量400-600m3\...

【专利技术属性】
技术研发人员：许有民，马辉，石光东，丁攀攀，
申请(专利权)人：通辽市黄河龙生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15