本发明专利技术涉及一种高透明度小核菌葡聚糖的提取方法，该方法主要是将小核菌发酵液升温至70-100℃，后迅速冷却至室温，采用的是二步酶解方法，第一步采用蛋白酶降解发酵液和菌丝体中的蛋白质，第二步采用破壁酶降解小核菌细胞壁，使胞内多糖进一步溶出，将提取的小核菌葡聚糖用水复溶，再用活性炭脱色，离心，清液采用0.5μm-5μm的膜过滤，得到高透明度小核菌葡聚糖溶液。本发明专利技术所获得的小核菌葡聚糖具有皮肤保湿功效，同时提升皮肤自体的修复能力，显著增强和恢复组织弹性等作用，主要用于轻工、医药、化妆品领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种葡聚糖的制备方法，特别是涉及到一种高透明度小核菌葡聚糖的提取方法。
技术介绍
小核菌多糖是由某些半知菌类,主要是小核菌属(Sclerotium sp.)的某些种产生的胞外多糖，其结构以β-1，3-糖苷键连接的聚葡萄糖为主链，每三个葡萄糖由β-1，6_糖苷键连结一个葡萄糖为侧链的葡聚糖。它具有优良的增稠性、假塑性、耐高温、高盐及较广范围的PH适应性，可广泛用于石油、油漆、陶瓷、食品等行业。小核菌葡聚糖具有较强的免疫调节活性，近年来研究发现，小核菌葡聚糖还具有皮肤保湿功效，同时提升皮肤自体的修复能力，显著增强和恢复组织弹性等功能，可广泛用于化妆品、沐浴露等日化产品。目前小核菌葡聚糖主要有两种提取方法，一、将发酵液用醇类沉淀，干燥得到的固体粉状粉末，它含有菌丝体，硬葡聚糖成分约占75% ;二、将发酵液经过过滤，除去菌丝体后再沉淀，干燥得到的粉状固体。无论上述哪种产品，都含有大量的色素等杂志、透明度差，主要用于石油开采等行业，达不到化妆品、沐浴露等日化行业的要求，没有充分发挥小核菌葡聚糖的功效。在中国专利(CNl204508)中披露了一种化妆品组合物，该组合物包含Α) —种化妆品上可接受的载体；以及Β)0. 05-3.0%(重量，基于整个组合物的重量)的、具有三维交联的三股螺旋结构的并且平均分子量为1Χ106-12Χ106的β — 1，3—小核菌葡聚糖。在中国专利(CNlO 1394898 )中披露了一种化妆品或药物组合物，该组合物含有小核菌葡聚糖，显示出有利的效果，例如润湿皮肤或粘膜，并对皮肤具有抗老化和修复效果适合在化妆品行业使用。在中国专利(CN101487384)中披露了一种利用小核菌多糖发酵液进行油井堵水的方法，从油井注入的方式依据发酵液堵高不堵低的特性进行选择性封堵，封堵高渗透层，堵水驱油效果明显，降低成本，施工安全，减少对地层的污染，可大幅提高原油的采收率。上述三个专利只是披露了小核菌葡聚糖作为一种活性物质可以用在化妆品、采油等行业，未提到小核菌葡聚糖的分离纯化方法，尤其是高透明小核菌葡聚糖的提取生产方法。
技术实现思路
针对现有技术中没有很好的高透明度的小核菌葡聚糖的提取方法的弊端，以及小核菌葡聚糖越来越多的应用，以及化妆品行业对于生物活性的要求，本专利技术提供了一种高透明度小核菌葡聚糖的提取方法，该方法主要是将小核菌发酵液升温至70-100°C，后迅速冷却至室温，采用二步酶解方法，第一步采用蛋白酶降解发酵液和菌丝体中的蛋白质，第二步采用破壁酶降解小核菌细胞壁，使胞内多糖进一步溶出，将提取的小核菌葡聚糖用水复溶，再用活性炭脱色，离心，清液采用O. 5 μ m-5 μ m的膜过滤，得到高透明度小核菌葡聚糖溶液。本专利技术所获得的小核菌葡聚糖具有皮肤保湿功效，同时提升皮肤自体的修复能力，显著增强和恢复组织弹性等作用，主要用于轻工、医药、化妆品领域。本专利技术所采用的小核菌菌株为从市场上直接购得的标准菌株，如保藏于中国药用微生物菌种保藏中心，菌株保藏编号=CPCC 400204，及其他市面可见的小核菌标准菌株。本专利技术的具体制备方法主要包括发酵液预处理、酶解、乙醇醇析、纯化四部分构成，具体步骤如下(I)发酵液预处理将小核菌发酵液升温至70-100 °C,保温10min-60min,冷却至室温备用；(2)酶解2)酶解采用下述方式中的任意一种进行酶解A.用碱性物质调节预处理发酵液pH值为7. 5-9. 0，开启搅拌，加入w/v为O. 01-0. 2%蛋白酶(也就是根据发酵液的体积确定加入蛋白酶的重量)，升温到50-60°C， 反应2-8h，将所得的酶解溶液冷却至35 °C，用酸性物质调节pH6. O,然后加入w/v为O. 01-0. 2%破壁酶，继续搅拌l_5h，酶解液加热至80-100°C，保温20_60min;B.用酸性物质调节pH6. 0，然后加入w/v为O. 01-0. 2%破壁酶，35_45°C搅拌l_5h，用碱性物质调节预处理发酵液PH值为7. 5-9. O,，加入w/v为O. 01-0. 2%蛋白酶，升温到50-60°C，反应 2-8h，酶解液加热至 80-100°C，保温 20_60min;(3)乙醇醇析将步骤(2)中获得的酶解液冷却至4_40°C，固液分离，清液加入乙醇，控制溶液中的乙醇浓度在v/v为40%-80%，混合搅拌30-90min，固液分离得小核菌葡聚糖沉淀；(4)纯化小核菌葡聚糖用水复溶，控制小核菌葡聚糖浓度w/v为O. 5-3%，加入w/V为O. 05-2%的活性炭，60-100°C保温20_60min，冷却至室温后，3000_6000r/min离心，清液8000-13000r/min再离心，清液采用O. 2 μ m_2 μ m的膜过滤，得到高透明度的小核菌葡聚糖溶液。步骤(I)发酵液预处理的目的是既可以杀灭小核菌菌体，保证小核菌葡聚糖的安全性；又可以使胞内的小核菌葡聚糖尽可能多的溶出，增加小核菌葡聚糖的收率；且由于加热使蛋白变性的缘故，小核菌菌体更容易与发酵液分离，减轻固液分离的难度。为了避免降温时间过长，一般需要采用外置手段，如热交换器等实现快速降温，以免降温时间过长带来的小核菌发酵液易褐变，影响产品品质的弊端。采用两步酶解法，即双酶法的目的I、采用蛋白酶，将发酵液的蛋白质以及结合蛋白充分的降解，让降解的氨基酸、肽等通过酒精醇沉留在乙醇溶液中，达到纯化小核菌葡聚糖的目的；2、采用破壁酶，降解小核菌的细胞壁，对小核菌胞内物质二次提取，提高小核菌葡聚糖的得率。步骤(3)醇析的目的采用40-80v/v%的酒精，这样既可以将目的产物小核菌葡聚糖醇沉下来，又可以使氨基酸、寡糖等杂质保留在液相中。通过30-60min的搅拌，使杂质充分的溶出，提高小核菌葡聚糖的纯度。步骤(4)小核菌葡聚糖复配成O. 5-3%的溶液，溶液的粘度达到300-1800cp，易于离心；采用活性炭处理小核菌葡聚糖，达到脱色的目的，尽可能的保留小核菌葡聚糖天然构像，保持其活性；采用二步离心脱除活性炭，采用低速分离设备，脱去大部分活性炭，然后采用高速离心机，彻底的脱除活性炭，而后通过膜过滤，脱除胶体以及不溶性微粒，得到小核菌葡聚糖的产品，这样既提高了工作效率，又保护了膜过滤设备。上述工艺过程中，所述酶解过程，采用的是二步酶解方法也就是前述的双酶法，第一步采用蛋白酶降解发酵液中的蛋白质，第二部采用破壁酶降解小核菌细胞壁，使胞内多糖更多的溶出，使非目的产物更多的留在醇水相中。酶解过程采用的蛋白酶可以是木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中的一种或几种混合物，也可以是其他中性蛋白酶或碱性蛋白酶或其混合物；使用的碱性物质为lmol/L的氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠中的一种或数种的混合物；使用的酸性物质为lmol/L或IOw/v%的苹果酸、柠檬酸、乙酸、盐酸、硫酸中的一种或数种的混合物，优选采用苹果酸、柠檬酸来调节溶液的酸碱性，这样可以 使苹果酸盐、柠檬酸盐通过醇析过程，留在醇水相中，降低小核菌葡聚糖溶液的盐含量。而本专利技术所采用的破壁酶为溶菌酶、纤维素酶、几丁质酶、半纤维素酶中的一种或多种；其中优选采用溶菌酶，或者用溶菌酶与其他酶的搭配。主要由于溶菌酶能有效地水解细胞壁的肽聚糖，其作用位点是N-乙酰胞壁酸(NAM)的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高透明度小核菌葡聚糖的提取方法，其特征在于：由下述工艺步骤完成：（1）发酵液预处理：将小核菌发酵液升温至70℃？100℃，保温10min？60min，冷却至室温;（2）酶解：采用下述方式中的任意一种进行酶解：A．用碱性物质调节预处理发酵液pH值为7.5？9.0，开启搅拌，加入w/v为0.01？0.2%蛋白酶，升温到50？60℃，反应2？8h，将所得的酶解溶液冷却至35℃，用酸性物质调节pH6.0，然后加入w/v为0.01？0.2%破壁酶，继续搅拌1？5h，酶解液加热至80？100℃，保温20？60min;B.用酸性物质调节pH6.0，然后加入w/v为0.01？0.2%破壁酶，35？45℃搅拌1？5h，用碱性物质调节预处理发酵液pH值为7.5？9.0，，加入w/v为0.01？0.2%蛋白酶，升温到50？60℃，反应2？8h，酶解液加热至80？100℃，保温20？60min;（3）乙醇醇析：将步骤（2）中获得的酶解液冷却至4？40℃，固液分离，清液加入乙醇，控制溶液中的乙醇浓度在v/v为40%？80%，混合搅拌30？90min，固液分离得小核菌葡聚糖沉淀;（4）纯化：小核菌葡聚糖用水复溶，控制小核菌葡聚糖浓度w/v为0.5？3％，加入w/v为0.05？2%的活性炭，60？100℃保温20？60min，冷却至室温后，3000？6000r/min离心，清液8000？13000r/min再离心，清液采用0.2μm？2μm的膜过滤，得到高透明度的小核菌葡聚糖溶液。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨传伦，马韵升，史庆苓，徐泽平，张心青，王秀芝，周传兵，
申请(专利权)人：黄河三角洲京博化工研究院有限公司，山东京博控股股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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