一种基因定点突变载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因定点突变载体及其构建方法和应用。本发明专利技术通过大量的优化，提供一种基因定点突变载体，通过CRISPR系统将胞嘧啶脱氨酶引导至胞嘧啶附近，将胞嘧啶变成尿嘧啶，随后植物细胞内的自发修复最终将尿嘧啶变成了胸腺嘧啶，最终在植物中实现C到T的定点突变，产生抗除草剂抗性。另外还可在非sgRNA靶点区域产生点突变，带来新的抗除草剂的重大农艺性状。

【技术实现步骤摘要】
一种基因定点突变载体及其构建方法和应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种基因定点突变载体及其构建方法和应用。
技术介绍
通过CRISPR-Cas9技术在生物体内进行基因编辑是生命科学领域内的重大突破。在引导RNA(gRNA)的引导下，gRNA-Cas9复合物专一结合与gRNA互补的DNA区域，并切断DNA双链，细胞随即展开修复。如果修复过程中没有可供修复的DNA模板，修复的过程会引入大量的随机突变；如果提供修复模板，就有可能将修复模板整合在DNA中，从而引入设计的突变类型。但是这两种基因编辑方式，都需要将DNA双链切开，且通过修复模板DNA引入，设计突变技术难度很大。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出一种基因定点突变载体及其构建方法和应用，具体技术方案如下：一种基因定点突变载体，在基础载体的基础上构建，5’到3’包括启动子、sgRNA、胞嘧啶脱氨酶基因、Cas9基因、尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因和终止子；所述sgRNA表达区含有植物除草剂所抑制的酶的相关基因的靶点序列；用XTEN将胞嘧啶脱氨酶基因连接在Cas9基因的5’端，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因连接在Cas9基因的3’端，核定位信号序列连接在尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因的3’端，进行植物偏好密码子的优化，得到优化的融合基因CT3，序列如SEQIDNo.1所示。所述基础载体为PHEE401E，序列如SEQIDNo.2所示；所述Cas9基因为D10A。所述载体为双元载体。所述启动子是植物内的组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。所述胞嘧啶脱氨酶基因来自人类基因组，Cas9基因来自嗜热链球菌，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因来自噬菌体。所述除草剂所抑制的酶的相关基因的靶点序列的胞嘧啶3`端方向23个碱基内具有PAM序列NGG。所述植物为粮食和油料作物，包括水稻、棉花、玉米、小麦、大豆、油菜、向日葵；蔬菜作物，包括白菜、甘蓝、黄瓜、番茄；水果作物，包括西瓜、甜瓜、草莓，蓝莓，葡萄；中草药，包括板蓝根、甘草、人参、防风；以及拟南芥；所述植物除草剂所抑制的酶的相关基因包括ALS、EPSPS、PPO、HPPD、PDS、ACCASE、GS、DOXPS、PsbA。一种基因定点突变载体的构建方法，包括如下步骤：1)用XTEN将胞嘧啶脱氨酶基因连接在Cas9基因的5’端，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因连接在Cas9基因的3’端，核定位信号序列连接在尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因的3’端，进行植物偏好密码子的优化，得到优化的融合基因CT3，序列如SEQIDNo.1所示；2)用步骤1)中CT3替换载体PHEE401E上的Cas9基因，所得载体命名为PHEE401CT；PHEE401E的序列如SEQIDNo.2所示；3)将除草剂所抑制的酶的相关基因的靶点序列克隆到PHEE401CT中的sgRNA表达区，至此PHEE401CT载体构建完成。步骤3)中除草剂所抑制的酶的相关基因为拟南芥ALS基因，序列如SEQIDNo.3所示。所述除草剂所抑制的酶的相关基因的靶点序列如SEQIDNo.4所示。一种抗除草剂植物的制备，包括如下步骤：将构建的PHEE401CT载体转到农杆菌中，通过蘸花法转化植株，通过喷施除草剂获得具有除草剂抗性的植株。一种基因定点突变载体在植物靶点序列产生C-T的突变。一种基因定点突变载体还在PAM序列NGG处产生点突变，形成NGA，实现重大农艺性状。一种基因定点突变载体在PAM序列TGG产生点突变，变成TGA。本专利技术的有益效果为：本专利技术通过大量的优化，提供一种基因定点突变载体，通过CRISPR系统将胞嘧啶脱氨酶引导至胞嘧啶附近，将胞嘧啶变成尿嘧啶，随后植物细胞内的自发修复最终将尿嘧啶变成了胸腺嘧啶，最终在植物中实现C到T的定点突变，产生抗除草剂抗性。另外还可在非sgRNA靶点区域产生点突变，带来新的抗除草剂的重大农艺性状。附图说明图1为引入靶点序列的方法。图2为苯磺隆(tribenuron)处理下，T2植株的抗性表现。图3为G202D导致除草剂抗性。具体实施方式本专利技术提出了一种基因定点突变载体及其构建方法和应用，下面结合实施例对本专利技术做进一步介绍。一、材料与试剂大肠杆菌杆菌感受态菌株EPI300，生态型拟南芥植株ArabidopsisthanlianaColumbia，农杆菌感受态菌株GV3101。DNA凝胶回收试剂盒，小提质粒试剂盒，购自Axygen生物技术公司。限制性内切酶：XbaI、SacI和BsaI。均购自NEB生物技术公司。T4连接酶购自TaKaRa生物技术公司，2xTaqMaterMix购自康为世纪生物技术公司。引物由天一辉远生物技术公司合成。抗生素：氨苄青霉素(Amp)储液100mg/ml、卡那霉素(Kan)储液100mg/ml、硫酸庆大霉素储液(Gen)100mg/ml、激霉素(Spe)150mg/ml、利福平(Rif)50mg/L、潮霉素B(购自Roche公司)。拟南芥转化辅助试剂SilwetL-77，购自中科瑞泰生物技术公司。其余化学试剂均购自sigma公司或国药集团化学试剂公司。二、溶液和培养基配方LB(1L)：10gTryptone，5gYeastextract，10gNaCl，调节pH值至7.0；固体含1.5％琼脂。MS培养基(1L)：4.4gMS盐，30g蔗糖，调PH至5.8-6.0；加植物凝胶7.5g。YEB(1L)：5gBeefextract，1gYeastextract，5gTryptone，5g蔗糖，0.5gMgSO4.7H2O，调节pH值至7.0；固体含1.5％琼脂。实施例1：拟南芥基因ALS定点突变的方法(1)用XTEN将胞嘧啶脱氨酶基因(rAPOBEC1)连接在Cas9基因(D10A)的5’端，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因(UGI)连接在Cas9基因(D10A)的3’端，核定位信号序列(NLS)连接在UGI的3’端，进行植物偏好密码子的优化，得到优化的融合基因CT3，序列如SEQIDNo.1所示。(2)用步骤(1)中优化的融合基因CT3替换载体PHEE401E上的Cas9基因，命名为PHEE401CT，载体PHEE401E序列如SEQIDNo.2所示。具体包括步骤如下：1)分别用XbaI、SacI双酶切PHEE401E质粒和优化的融合基因CT3，反应体系(40μL)如下：2)回收纯化酶切产物，将纯化回收后的两种DNA片段进行连接，连接体系(10μL)如下：用移液器轻轻吹打混合均匀，室温离心数秒，于20-25℃孵育连接1-2h，或16℃孵育连接过夜。3)从-70℃超低温冰柜中取出一管(100μL)感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴10min，加入10μL连接产物，轻轻震荡后放置冰上20min，轻轻摇匀后插入42℃水浴中90秒进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min，在超净工作台中向上述各管中分别加入900μLLB培养基轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡复苏50min。4)复苏结束后于5000r/min室温离心1min，吸去800μL上清，然后重悬菌体，将菌体涂布于含有Amp和Kan的LB固体平板上，37℃倒置培养过夜。5)用无菌牙签挑取白色单菌落用CT3-IDF和CT3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因定点突变载体，其特征在于，所述载体在基础载体的基础上构建，5’到3’包括启动子、sgRNA、胞嘧啶脱氨酶基因、Cas9基因、尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因和终止子；所述sgRNA表达区含有植物除草剂所抑制的酶的相关基因的靶点序列；用XTEN将胞嘧啶脱氨酶基因连接在Cas9基因的5’端，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因连接在Cas9基因的3’端，核定位信号序列连接在尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因的3’端，进行植物偏好密码子的优化，得到优化的融合基因CT3，序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
2016.12.30 CN 20161125507641.一种基因定点突变载体，其特征在于，所述载体在基础载体的基础上构建，5’到3’包括启动子、sgRNA、胞嘧啶脱氨酶基因、Cas9基因、尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因和终止子；所述sgRNA表达区含有植物除草剂所抑制的酶的相关基因的靶点序列；用XTEN将胞嘧啶脱氨酶基因连接在Cas9基因的5’端，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因连接在Cas9基因的3’端，核定位信号序列连接在尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因的3’端，进行植物偏好密码子的优化，得到优化的融合基因CT3，序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述基础载体为PHEE401E，序列如SEQIDNo.2所示。3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述Cas9基因为D10A。4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体为双元载体。5.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述启动子是植物内的组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。6.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨酶基因来自人类基因组，Cas9基因来自嗜热链球菌，尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂基因来自噬菌体。7.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述除草剂所抑制的酶的相关基因的靶点序列的胞嘧啶3`端方向23个碱基内具有PAM序列NGG。8.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述植物为粮食和油料作物，包括水稻、棉花、玉米、小麦、大豆、油菜、向日葵；蔬菜作物，包括白菜、甘蓝、黄瓜、番茄；水果作物，包括西瓜、...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜临建，陈其军，倪汉文，许勇，陈易雨，王志平，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11