丙烯酸酯化的透明质酸制造技术

本发明专利技术涉及具有以下结构的丙烯酸酯化透明质酸产物及其生产方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】丙烯酸酯化的透明质酸专利
本专利技术涉及用于产生丙烯酸酯化的透明质酸(acrylated hyaluronic acid (HA))的方法、该方法的产物和这些产物的用途。专利技术背景透明质酸(HA)是天然的线性糖类聚合物，其属于非石克酸化的(non-sulfated) 糖胺聚糖类。它由P-l，3-A^-乙酰葡糖胺和(3-l,4-葡糖醛酸的重复二糖单元组成， 具有多至6MDa的分子量(MW)。 HA存在于透明软骨、滑膜关节液(synovial joint fluid)和真皮和表皮皮肤组织中。可以从天然组织包括脊推动物的结締组 织，从人脐带和从鸡冠(cocks，comb)中提取HA。然而，现今优选的是通过微 生物方法制备透明质酸以使转移传染剂的潜在风险最小化，并且增加产物均 匀性、品质和可用性(美国专利No. 6,951,743; WO 03/0175902)。已经鉴定了 HA在体内的多种功能。它在生物体中作为对许多组织(例如 皮肤、腱、肌肉和软骨)细胞的机械支持而发挥重要作用。HA参与了关键的 生物学过程，例如组织的湿润，和润滑。还猜想它在许多生理功能中具有作 用，例如粘附、发育、细胞运动性、癌、血管发生和愈伤。由于HA独特的 物理和生物学性质(包括粘弹性、生物相容性、生物可降解性)，将HA广泛应 用在化妆品、眼科学、风湿病学、药物和基因递送、愈伤以及组织工程中现 有的和正在发展的应用中。在这些应用中的一些中HA的使用受到下述事实 的限制，即在室温也就是大约20。CHA溶于水，在体内其被透明质酸酶迅速 降解，和难以将其加工成生物材料。因此引入了 HA的交联，从而改进HA 的物理和机械性质及其体内滞留时间。可以将丙烯酸酯化的HA用于进行酶介导的交联和产生水凝胶形式的材 料。交联的HA可以用在化妆品、生物医学和药物应用中。通过交联HA，可 以设计用于特定应用的具有特定性质的化合物。丙烯酸酯化的HA提供官能 化的反应性基团，其能够通过迈克尔型加成进一步修饰来引入用于不同应用 的生物活性肽。通过合成缩水甘油基曱基丙烯酸酯陽HA (glycidyl methacrylate画HA) (GMHA)缀合物(conjugate)来引入HA上的丙烯酸酯基团。GMHA衍生物可用 于制备HA仿生水凝胶，以促进组织修复和愈伤。也已经发现缀合的曱基丙 烯酸酯基团的量的增加与交联密度的增加和降解速率的下降一致，并且对人 主动脉上皮细胞的细胞相容性(cytocompatability)和增殖的作用不显著。已经 通过如下方法制备了 GMHA衍生物在过量三曱胺和溴化四丁铵存在下，于 室温，用6倍、10倍和20倍摩尔(molar)过量的缩水甘油基曱基丙烯酸酯过 夜处理发酵衍生的HA (~2乂106分子量)在蒸馏水中的1% w/v溶液，继而在 60。C温育1小时。例如，通过将1.0 g HA溶解(dissolution)在100 ml蒸馏水 中来制备具有六倍摩尔过量GM的GMHA。向所述溶液添加2.2 ml三乙胺、 2.2ml缩水甘油基曱基丙烯酸酯和2.2g溴化四丁铵，并且搅拌过夜，继而在 60。C温育 一 小时。通过这种方法获得了 5%的曱基丙烯酸酯化 (methacrylation)。使用10倍和20倍摩尔过量获得了 7和11%的丙烯酸酯化 (acrylation) (Leach and Schmidt, 2005, 26, 125-135; Yonese ef a/.,2002， C/zem.泡肌M/. 50, 1341-1348; Schmidt 2003，肠fec/mo/ogy朋d 5/oewg7'"em'"g 82(5), 578-589)。也已通过将HA溶解在pH ll.O的碳酸盐緩冲液中制备了 GMHA缀合物。 将缩水甘油基曱基丙烯酸酯添加至上述溶液，并将混合物在室温搅拌7天。 用HC1将所得溶液的pH调至7.0。将其过滤并冷冻干燥(Yonese, o/Co"fra〃Wi e/mse 73, 173-181)。将GMHA缀合物进一步与丙烯酸羟乙基酯 交联以制备水凝胶。还已经通过下述方法引入了 HA上的丙烯酸酯基团，即通过对HA上存 在的羧基进行修饰来合成iV-3-氨基丙基曱基丙烯酰胺-HA缀合物。随后将天 然和酶法降解的HA用于化学修饰。使用7V-(3-氨丙基)曱基丙烯酸酰胺作为丙 烯酸酯化剂对两种HA进行了修饰。在作为偶联剂的N-(3-二曱基氨基丙 基)-N'-乙基》灰二亚胺(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'國ethylcarbodiimide) (EDCI) 的存在下，氨基丙基与HA的羧基反应，导致形成在另一端带有丙烯基侧基 的酰胺键。在典型的反应中将HA溶于蒸馏水。向溶液中加入EDCI然后是 ,3-氨基丙基甲基丙烯酸酰胺。将反应混合物在pH 6.5温育两小时，然后是 随后添加EDCI和iV-3-氨基丙基甲基丙烯酸酰胺，再进一步在室温温育2小 时。将溶液过滤，相对于NaCl然后是水进行透析，并最终冻干以产生曱基丙烯酸酯化的HA。达到的丙烯酸酯化的程度大约是10% (Tirelli ef a/.， 2003， 5/omaten'a&， 24， 893-900; Kim and Park 2002， Jow/72a/ o/Co"rra//e<i7 e/eose, 80, 69-77)。已经通过向用NaOH调节为pH 8的1 % HA在去离子水中的溶液添加曱 基丙烯酸酐( 20倍)，并且在冰上反应24小时而合成了曱基丙歸酸酯化的透 明质酸(HAMA)。将修饰的多糖沉淀并且用乙醇洗涤以去除曱基丙烯酸酐。 在所述方法中可以实现多至17%的曱基丙烯酸酯化。实现的低％曱基丙烯酸 酯化(17%)是因为曱基丙烯酸酐与HA羟基的低反应性(Smeds and Grinstaff 2001, Jowma;/0/所0mWca/M她n油i aseorc/z， 54, 115-121; Langer e/a/" 2005， 5/omacrawo/ecw/&s, 6, 386-391)。用于丙烯酸酯化HA的已知方法是费时并且复杂的，本领域中需要更简 单的用于丙烯酸酯化HA的方法。本专利技术的目的是提供用于丙烯酸酯化透明 质酸的简单方法。专利技术概述本专利技术涉及产生丙烯酸酯化的透明质酸的方法，所述方法包括步骤(a) 制备包含透明质酸的pH7-ll的水成液(aqueous liquid);(b) 制备包含丙烯酰氯(acryl chloride)和二氯曱烷/乙醚的有机液(organic liquid); 和(c) 将(b)的有机液与(a)的水成液混合，其中将pH保持在7-11。 本专利技术还涉及具有以下结构的丙烯酸酯化的透明质酸产物本专利技术的方法非常快速，因为使用的丙烯酸酯化试剂的反应性非常高， 由此降低了常规反应时间。使用本专利技术的方法实现的。/。丙烯酸酯化要高得多。 与使用复杂方法的迄今为止报导的17%相比，使用所述简单快速的方法能够 在短得多的反应时间(l-2小时)内达到>90°/。的丙烯酸酯化。这是不使用任何偶联剂时达到的最高％丙烯酸酯化。另外，相较于已经报导的规程，在本专利技术 的方法中获得的副产物少得多，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有以下结构的丙烯酸酯化透明质酸产物：　＊＊＊。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：理查德A格罗斯，维尼特库玛，
申请(专利权)人：诺维信生物聚合物公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]