禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法技术

本发明专利技术提供一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，其包括以下步骤：壳膜与钙化壳的分离；将壳膜干燥、粉碎；从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖；去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素，将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离。本发明专利技术的方法可以分离出高纯度的透明质酸，直接从禽类蛋壳中提取透明质酸，不仅来源广泛，而且得到的透明质酸来自动物的自然组织，分子量稳定，无内毒素。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于透明质酸的提取领域，具体涉及一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法。
技术介绍
透明质酸是一种富含阴离子的直链线性大分子多糖，能够和动物体内多种细胞生长因子、酶、细胞因子以及受体相结合，诱发信号转导，从而调控细胞生长、分化及凋亡。因此，透明质酸被广泛用于医药(例如，用于治疗关节炎、肌腱和软组织损伤、作为癌症纳米药物佐剂等)、食品保健和化妆品(例如，用于抗皱化妆品等)领域。目前，透明质酸的来源主要有两种方法，一种是动物组织，如公鸡鸡冠、胎儿肚脐，多来源于屠宰车间或医院；另一种是通过微生物发酵。前一种方法由于动物组织产量有限，限制透明质酸的产量；后一种方法，由于产生的透明质酸分子量(长度)较难把握，且容易受内毒素污染，影响了透明质酸的进一步应用。
技术实现思路
有鉴于此，实有必要提供一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，该方法可以分离出高纯度的透明质酸，直接从禽类蛋壳中提取透明质酸，不仅来源广泛，而且得到的透明质酸来自动物的自然组织，分子量稳定，无内毒素。本专利技术提供的禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，包括以下步骤：壳膜与钙化壳的分离：用体积浓度为2～20％乙酸，或者质量浓度为1～5wt％的EDTA二钠盐/EDTA四钠盐浸泡蛋壳，将壳膜分离；将壳膜干燥、粉碎；从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖，具体包括：采用蛋白酶去除壳膜中的蛋白质；以及用阴离子交换柱/阴离子交换树脂，依次采用不同浓度NaCl水溶液进行洗脱分离提取总糖胺聚糖，或者用氯化十六烷吡啶进行沉淀、离心提取总糖胺聚糖；所述阴离子交换柱为Vivapure Q Max H阴离子交换柱；所述阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800；去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素，具体包括：ⅰ)用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素在水溶液或50mM，pH为7～9的Tris-HCl缓冲液中水解成碎片，得到反应液1备用；ⅱ)将反应液1循环2遍加入Vivapure Q Max H阴离子交换柱或往反应液1中加入强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800结合过夜(反应液1与树脂体积比为(5～30)：1)，依次用不同浓度的NaCl水溶液洗脱、脱盐得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合物；或者往反应液1中加入NaCl，使得最终NaCl的浓度为0.5M，煮3分钟使酶变性沉淀，之后离心、取上清液，往上清液加入含饱和乙酸钠的体积浓度为70～95％的乙醇，于2～8℃过夜，以将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物沉淀析出；将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离，具体包括：采用Q-Sepharose阴离子交换层析柱，Easy Purification Systems纯化系统或HPLC系统，用浓度范围为0.05～5M，浓度梯度为0.2～0.5M的NaCl水溶液对透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物进行梯度洗涤和洗脱，设置检测光波的激发波长214nm、发射波长280nm，收集、标记检测峰对应的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素。优选地，壳膜与钙化壳的分离过程中，蛋壳浸泡的时间为12～96h。优选地，所述将壳膜干燥、粉碎，具体包括：将壳膜冷冻干燥1～5天，或者于20～90℃烘1～5天；用粉碎仪或超细粉碎仪将壳膜粉碎。优选地，所述采用蛋白酶去除壳膜中的蛋白质，具体包括：将壳膜粉悬浮于含0～0.6wt％十二烷基磺酸钠的PBS缓冲液中，所述磷酸盐
缓冲液的pH值为7～11，所述壳膜与PBS缓冲液的质量比为1：(10～80)；加入链霉蛋白酶Actinase E，于37～39℃下进行水浴处理12～28小时，Actinase E与壳膜的质量比为1：(2～50)；于90～95℃灭活Actinase E 10～30分钟；加入蛋白酶K于53～56℃水浴处理6～24小时，蛋白酶K与壳膜质量比为1：(70～100)，于90～95℃灭活蛋白酶K 10～40分钟；或者用碱性蛋白酶于53～63℃水浴处理6～24小时，酶与壳膜质量比1：(80～100)；于90～95℃灭活碱性蛋白酶10～40分钟；用悬浮桶转子3200～6000xg离心力离心上述经蛋白酶消化后的样品，取上清液备用。优选地，所述用阴离子交换柱/阴离子交换树脂，依次采用不同浓度NaCl水溶液进行洗脱分离提取总糖胺聚糖，具体包括：将上清液循环两遍加入Vivapure Q Max H阴离子交换柱(或往上清液中加入强碱性阴离子交换树脂Lewatit MonoPlus M800结合过夜，上清液与树脂体积比为(5-30)：1)，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤去除阴离子交换柱(或阴离子交换树脂)上的杂蛋白或杂质，最后3.3M的NaCl水溶液洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液，将总糖胺聚糖盐溶液用超滤管或透析袋脱盐，所述超滤管或透析袋的截留量为3～10kDa；或者将总糖胺聚糖盐溶液用4～5倍体积的甲醇于-20～8℃沉淀12～18小时，再用体积浓度95％甲醇连续洗涤沉淀3遍；将沉淀物冻干或空干得总糖胺聚糖；优选地，所述用氯化十六烷吡啶进行沉淀、离心提取总糖胺聚糖，具体包括：直接往上清液中加入氯化十六烷吡啶至每100mL上清液中含0.01～0.5g氯化十六烷吡啶，混匀后于2～8℃放置过夜以沉淀总糖胺聚糖，于2～8℃用固定角转子15000～30000xg离心力离心去除上清液，用含5～20wt％乙酸钾的70～95％乙醇洗涤沉淀3遍，再用70～95％乙醇洗涤沉淀3遍，空干沉淀，即得到总糖胺聚糖。优选地，所述用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素在水溶液或50mM Tris-HCl缓冲液中水解成碎片，具体包括：将总糖胺聚糖溶解于水或50mM，pH为7～9的Tris-HCl缓冲液中，加入肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶，于37℃反应12～24小时，以将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素水解成碎片。优选地，每微克总糖胺聚糖中肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶用量分别为0.01～0.15mU、0.1～1mU、0.5～3mU和0.01～0.3mU。优选地，所述将反应液1加入阴离子交换柱或往反应液1中加入阴离子交换树脂结合过夜，依次用不同浓度的NaCl水溶液洗脱、脱盐得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合物，具体包括：将反应液1循环两遍加入Vivapure QMax H阴离子交换柱或往反应液1中加入强碱性阴离子交换树脂LewatitMonoPlus M800结合过夜，上清液与树脂体积比为(10-30)：1，依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤去除阴离子交换柱或阴离子交换树脂上糖胺聚糖水解后的碎片及其它杂质，再用3.3M的NaCl水溶液洗脱获得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合盐溶液，最后用超滤管或透析袋脱盐，所述超滤管或透析袋的截留量3～10kDa；或者先用0.5～5倍体积的甲醇于-20～8℃沉淀12～18小时，用固定角转子15000～30000xg离心力离心去除上清液，得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素沉淀，再用体积浓度70～95％甲醇洗涤沉淀3遍，最后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：壳膜与钙化壳的分离：用体积浓度为2～20％乙酸，或者质量浓度为1～5wt％的EDTA二钠盐/EDTA四钠盐浸泡蛋壳，将壳膜分离；将壳膜干燥、粉碎；从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖，具体包括：采用蛋白酶去除壳膜中的蛋白质；以及用阴离子交换柱/阴离子交换树脂，依次采用不同浓度NaCl水溶液进行洗脱分离提取总糖胺聚糖，或者用氯化十六烷吡啶进行沉淀、离心提取总糖胺聚糖；去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素，具体包括：ⅰ)用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素在水溶液或50mM，pH为7～9的Tris‑HCl缓冲液中水解成碎片，得到反应液1备用；ⅱ)将反应液1加入阴离子交换柱或往反应液1中加入阴离子交换树脂结合过夜，依次用不同浓度的NaCl水溶液洗脱、脱盐得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合物；或者往反应液1中加入NaCl，使NaCl的最终浓度为0.5M，煮沸后离心、取上清液，往上清液加入含饱和乙酸钠的体积浓度为70～95％的乙醇，于2～8℃过夜，以将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物沉淀析出；将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离，具体包括：采用Q‑Sepharose阴离子交换层析柱，Easy Purification Systems纯化系统或HPLC系统，用0.05～5M的NaCl水溶液对透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物进行梯度洗涤和洗脱，设置检测光波的激发波长214nm、发射波长280nm，收集、标记检测峰对应的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素。...

【技术特征摘要】
1.一种禽类蛋壳膜中透明质酸的提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：壳膜与钙化壳的分离：用体积浓度为2～20％乙酸，或者质量浓度为1～5wt％的EDTA二钠盐/EDTA四钠盐浸泡蛋壳，将壳膜分离；将壳膜干燥、粉碎；从粉碎壳膜中分离、提取总糖胺聚糖，具体包括：采用蛋白酶去除壳膜中的蛋白质；以及用阴离子交换柱/阴离子交换树脂，依次采用不同浓度NaCl水溶液进行洗脱分离提取总糖胺聚糖，或者用氯化十六烷吡啶进行沉淀、离心提取总糖胺聚糖；去除总糖胺聚糖中的肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素，具体包括：ⅰ)用肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及角质素酶将肝素/硫酸乙酰肝素、硫酸角质素在水溶液或50mM，pH为7～9的Tris-HCl缓冲液中水解成碎片，得到反应液1备用；ⅱ)将反应液1加入阴离子交换柱或往反应液1中加入阴离子交换树脂结合过夜，依次用不同浓度的NaCl水溶液洗脱、脱盐得透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素的混合物；或者往反应液1中加入NaCl，使NaCl的最终浓度为0.5M，煮沸后离心、取上清液，往上清液加入含饱和乙酸钠的体积浓度为70～95％的乙醇，于2～8℃过夜，以将透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物沉淀析出；将透明质酸与硫酸软骨素/硫酸皮肤素分离，具体包括：采用Q-Sepharose阴离子交换层析柱，Easy Purification Systems纯化系统或HPLC系统，用0.05～5M的NaCl水溶液对透明质酸、硫酸软骨素/硫酸皮肤素混合物进行梯度洗涤和洗脱，设置检测光波的激发波长214nm、发射波长280nm，收集、标记检测峰对应的透明质酸或硫酸软骨素/硫酸皮肤素。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，壳膜与钙化壳的分离过程中，蛋壳浸泡的时间为12～96h。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将壳膜干燥、粉碎，具体包括：将壳膜冷冻干燥1～5天，或者于20～90℃烘1～5天；用粉碎仪或超细粉 碎仪将壳膜粉碎。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用蛋白酶去除壳膜中的蛋白质，具体包括：将壳膜粉悬浮于含0～0.6wt％十二烷基磺酸钠的PBS缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7～11，所述壳膜与PBS缓冲液的质量比为1：(10～80)；加入链霉蛋白酶Actinase E，于37～39℃水浴处理12～28小时，Actinase E与壳膜的质量比为1：(2～50)；于90～95℃灭活Actinase E 10～30分钟；加入蛋白酶K于53～56℃水浴处理6～24小时，蛋白酶K与壳膜质量比为1：(70～100)，于90～95℃灭活蛋白酶K 10～40分钟；或者用碱性蛋白酶于53～63℃水浴处理6～24小时，酶与壳膜质量比1：(80～100)，于90～95℃灭活碱性蛋白酶10～40分钟；用悬浮桶转子3200～6000xg离心力离心上述经蛋白酶消化后的样品，取上清液备用。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用阴离子交换柱/阴离子交换树脂，依次采用不同浓度NaCl水溶液进行洗脱分离提取总糖胺聚糖，具体包括：将上清液加入阴离子交换柱，或往上清液中加入阴离子交换树脂结合过夜，上清液与树脂体积比为(5～30)：1；依次用0.1M、0.5M的NaCl水溶液洗涤去除阴离子交换柱或阴离子交换树脂上的杂蛋白或杂质，最后3.3M的NaCl水溶液洗脱获得总糖胺聚糖盐溶液，将总糖胺聚糖盐溶液用超滤管...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘长国，赵红娟，
申请(专利权)人：刘长国，
类型：发明
国别省市：浙江;33