一种通过原生质体快速验证启动子强弱的方法技术

本发明专利技术提出了一种通过原生质体快速验证启动子强弱的方法，通过在同一个载体上用目标启动子和参考启动子分别驱动同一种荧光蛋白，在同一个细胞中表达，但是分别定位在不同的亚细胞位置，然后再利用同一个激光束激发荧光蛋白，此种情况下所有的其他参数都是一致的情况下，不同的亚细胞位置上的荧光亮度就可以代表启动子的强度，通过与参考启动子比较可以定量分析出目标启动子与参考启动子的倍比关系。本发明专利技术只需构建一次插入了待验证启动子序列的载体，然后用构建好的载体转化原生质体再在激光共聚焦显微镜下观察拍照通过比较对照启动子产生的荧光强度和需验证的启动子产生的荧光强度的方式快速评价启动子活性的强弱。

【技术实现步骤摘要】
一种通过原生质体快速验证启动子强弱的方法
本专利技术涉及一种通过原生质体快速验证启动子强弱的方法。
技术介绍
随着全基因组测序技术、分子生物学、生物信息学的快速发展，有大量的基因被测序和克隆，在功能基因研究中，基因启动子研究分析是主要的组成部分，所以对启动子的活性研究至关重要。常规分析植物启动子活性的方法是通过转基因技术，获得稳定的转基因株系用gus作为报告基因，通过用gus染色，根据染色深浅判断启动子的强度，此类技术实验周期长(4-6个月)无法做到精细定量，工作量大，成本高。
技术实现思路
本专利技术提出了一种通过原生质体快速验证启动子强弱的方法，只需构建一次插入了待验证启动子序列的载体，然后用构建好的载体转化原生质体再在激光共聚焦显微镜下观察拍照通过比较对照启动子产生的荧光强度和需验证的启动子产生的荧光强度的方式快速评价启动子活性的强弱。本专利技术具体是通过以下技术方案来实现的：一种通过原生质体快速验证启动子强弱的方法，通过在同一个载体上用目标启动子和参考启动子分别驱动同一种荧光蛋白，在同一个细胞中表达，但是分别定位在不同的亚细胞位置，然后再利用同一个激光束激发荧光蛋白，此种情况下所有的其他参数都是一致的情况下，不同的亚细胞位置上的荧光亮度就可以代表启动子的强度，通过与参考启动子比较可以定量分析出目标启动子与参考启动子的倍比关系。优选地，所述参考启动子可以是任意启动子，荧光蛋白也可以是任意荧光蛋白，激光波长根据荧光蛋白设定。优选地，亚细胞位置为植物中央大液泡膜和细胞质膜。优选地，目标启动子和参考启动子必须在同一个DNA分子上，保证其拷贝数1:1。本专利技术产生的有益效果为：本专利技术基于在原生质体中质粒表达携带不同定位信号的荧光蛋白可在特定细胞组织聚集，荧光强弱和荧光蛋白表达量正相关，启动基因转录能力强的启动子比启动基因转录能力弱的启动子产生荧光蛋白要多能产生的荧光要强，通过激光共聚焦显微镜可记录荧光强度信号，比较荧光信号强弱评价启动子活性强弱。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为载体pBWA(V)HS-35scm-ccdbattpk1构建结构图。图2为在激光扫描共聚焦显微镜下观察的原生体质粒表达荧光图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。如图1为构建好的pBWA(V)HS-35scm-ccdbattpk1载体，载体特征在于有两个基因表达单元，一个为参考启动子+cmmkmarker(细胞膜定位信号+绿色荧光蛋白)；另一个为ccdb+attpkosgfp(液泡膜定位信号+绿色荧光蛋白)。其中CCDB为目标启动子待置换区。此载体通过常规的分子生物学手段很容易构建，构建方法不在赘述。参考启动子可是任何类型的用于启动基因转录的启动子。用于对比的荧光蛋白是任何颜色荧光蛋白中的一种，但是同一个载体上的荧光蛋白必须只能有一种。用于对照的和检测用的荧光蛋白分别定位于细胞膜和液泡膜或者液泡膜和细胞膜。2，将目标启动子克隆进入验证载体。首先将分析载体用双酶切将CCDB片段切下，然后目标启动子通过常规的酶切链接方法连入载体，即可以完成载体构建。3，转化植物原生质体，并用激光共聚焦观察。验证UBI启动子效率将UBI启动子构建到载体pBWA(V)HS-35scm-ccdbattpk1中。合成如下引物一对用于扩增UBI启动子序列。UBI(+):cagtGGTCTCatagatcgtgcccctctctagagataatgaUBI(-):cagtGGTCTCagttgcagaagtaacaccaaacaacagggt做1个50ul体系的PCR反应:＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ThePCRsystem&cycles＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝Total:50ulSum:1H2O:3434ulbuffer:55ulMg2+:44uldNTP:22ulP+:22ulP-:22ultaq:22UTemplate:1ul-----------pcrcycle-------------94℃for5min+++++++++++30cycles94℃for30sec50℃for45sec72℃for118sec+++++++++++++72℃for10min16℃for30min将pcr产物与载体pBWA(V)HS-35scm-ccdbattpk1进行连接。＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝TheDigesting-linkProtocal＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝total:20ulSum:1H2O:88ulBuffer:22ulBsaI/Eco31I:11ulT4_ligase:11ulpBWA(V)HS-35scm-ccdbattpk1:44ulrDNAU1:44ul--------TheDigest-Link(DL)procedure--------37℃for20min++++++++5cycles37℃for10min20℃for10min++++++++37℃for20min80℃for5min将连接产物转化感受态＝＝＝＝＝＝＝＝＝转化＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝将5-10ul连接产物转化大肠杆菌感受态(见大肠杆菌感受态转化标准方法)转化涂(卡纳霉素)抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑pcr鉴定。＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝菌斑PCR鉴定＝＝＝＝＝＝＝＝挑取10个菌斑同时进行1.5mlEP管接菌和PCR鉴定,引物：pBWA(V)HS-35scm-UBIattpk1鉴定引物UBI(+)，UBI(-).＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝PCRsystem＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝做10个25ul体系的PCR反应:＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ThePCRsystem&cycles＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝Total:25ulSum:10H2O:16.5165ulbuffer:2.525ulMg2+:220uldNTP:110ulUBI(+):110ulUBI(-):110ultaq:110UTemplate:1ul-----------pcrcycle-------------94℃for5min+++++++++++30cycles94℃for30sec50℃for45sec72℃for118sec+++++++++++++72℃for10min16℃for30min获取正确克隆，进一步通过测序验证获得构建好的pBWA(V)HS-35scm-UBIattpk1。转化原生质体25℃暗培养水稻种子1-2周，将新鲜的水稻苗切段，加入适量酶解液(1.5％CellulaseR10,0.75％MacerozymeR10,0.6Mmannitol,10mMMESpH5.7,10mMCaCl2and0.1％BSA)。15-20℃轻轻摇晃(20-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过原生质体快速验证启动子强弱的方法，其特征在于，通过在同一个载体上用目标启动子和参考启动子分别驱动同一种荧光蛋白，在同一个细胞中表达，但是分别定位在不同的亚细胞位置，然后再利用同一个激光束激发荧光蛋白，此种情况下所有的其他参数都是一致的情况下，不同的亚细胞位置上的荧光亮度就可以代表启动子的强度，通过与参考启动子比较可以定量分析出目标启动子与参考启动子的倍比关系。

【技术特征摘要】
1.一种通过原生质体快速验证启动子强弱的方法，其特征在于，通过在同一个载体上用目标启动子和参考启动子分别驱动同一种荧光蛋白，在同一个细胞中表达，但是分别定位在不同的亚细胞位置，然后再利用同一个激光束激发荧光蛋白，此种情况下所有的其他参数都是一致的情况下，不同的亚细胞位置上的荧光亮度就可以代表启动子的强度，通过与参考启动子比较可以定量分析出目标启动子与参考启动子的倍比关系。2.如权利要求1所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：李阳，孙智光，
申请(专利权)人：武汉伯远生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42