本发明专利技术涉及一种利用原生质体通过毛细管电泳检测细菌的方法，所述方法如下：(1)制备原生质体；(2)将待检测的细菌原生质体和与所述原生质体相互作用的ssDNA或药物用毛细管电泳缓冲液配制成样品，样品中，原生质体悬液的浓度为105～109CFU/mL，ssDNA溶液的浓度为2～20μM，药物溶液的浓度为0.5～10mmol/L；(3)将步骤(2)制备得到的样品进行毛细管电泳检测。所述方法通过实现ssDNA或药物对原生质体的识别，进而实现对细菌的检测；可克服现有核酸分子与微生物发生相互作用识别检测微生物的方法中存在的相互作用位点少以及相互作用力弱的缺陷，具有准确、快速、简便以及成本低特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，具体地说，涉及一种应用毛细管电泳检测原生质体与单链DNA(single-stranded DNA, ssDNA)或药物的相互作用，实现ssDNA或药物对原生质体的识别，进而实现对细菌的检测，属于生物分析领域。
技术介绍
目前，微生物检测分析的方法主要有生理生化鉴定、气相色谱、免疫学、分子生物学、傅里叶变换红外光谱、三维荧光光谱以及毛细管电泳等方法。其中，毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE),又称高效毛细管电泳 (highperformance capillary electrophoresis, HPCE),是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，以样品的多种特性，如电荷、大小、等电点、极性、亲和行为以及相分配特性等为根据的液相微分离分析技术。毛细管电泳的工作原理为某物质在受到其它物质的各种作用，包括化学、物理和生物的作用后，该物质自身的荷电情况、几何尺寸、构型及具有原性质形态的浓度等性质将发生改变。在毛细管电泳谱图中，所述改变表现为该物质的迁移时间、峰高、峰面积的改变。CE是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学得以从微升水平加入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能，生物大分子如蛋白质的分离分析也因此有了新的转机。毛细管电泳具备以下优点高效，自由溶液CE的效率在105 106理论塔板之间；快速，几十秒至十几分钟完成分离；微量，进样所需的样品体积可小到luL，试剂消耗体积在I 50nL ；多模式，仅需一台仪器就可根据需要选用不同的分离模式；样品对象广，可从无机离子到整个细胞，具有很强的分析功能和潜力；自动，通常使用水溶液，对人对环境无害，实属“绿色”分析技术。目前，CE已成为重要的分离技术，在生物、医药以及化工等领域具有广阔的应用前旦-5^ O基于小分子与微生物的相互作用对微生物进行检测，目前已有关于核酸分子与微生物发生相互作用识别检测微生物的报道，但能够与核酸分子发生相互作用的微生物非常少，因为微生物的细胞壁具有强屏蔽作用，使微生物能与核酸分子相互作用的位点非常少， 即使有相互作用的位点，这些位点的相互作用力也非常微弱，所以大大限制了利用小分子与微生物的相互作用以识别检测微生物的准确率和应用范围。原生质体指在人为条件下，去除原有细胞壁或抑制新生细胞壁后所得到的仅有一层细胞膜包裹着的圆球状对渗透敏感的细菌。现有技术中主要是通过酶法去掉细菌的细胞壁制备得到原生质体，由不同细菌制备的原生质体具有该细菌的特性，原生质体在适宜条件下可生长繁殖形成与原细菌生物活性基本相同的细菌，因此对原生质体的识别即等同于对原生质体所属细菌的识别。研究ssDNA或药物对原生质体的识别，进而实现对相关细菌的检测，具有重要的理论和应用价值，目前还未见有关于应用毛细管电泳检测原生质体与 ssDNA或药物的相互作用实现对细菌检测的方法的报道。
技术实现思路
为实现准确、快速、简便、低成本地检测细菌，本专利技术的目的在于提供，所述方法应用毛细管电泳检测原生质体与ssDNA 或药物的相互作用，实现ssDNA或药物对原生质体的识别，进而实现对细菌的检测；可克服现有核酸分子与微生物发生相互作用识别检测微生物的方法中存在的相互作用位点少以及相互作用力弱的缺陷，具有准确、快速、简便以及成本低特点。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的。，所述方法步骤如下(I)制备原生质体采用生物领域中制备细菌原生质体的常规技术手段进行制备。(2)毛细管电泳检测用样品配制将待检测的细菌原生质体和与所述原生质体相互作用的ssDNA或药物采用毛细管电泳缓冲液配制成样品，样品中，原生质体悬液的浓度为IO5 109CFU/mL，ssDNA溶液的浓度为2 20 μ M,药物溶液的浓度为O. 5 10mmol/L。(3)毛细管电泳检测样品将步骤(2)制备得到的样品进行毛细管电泳检测，所述毛细管电泳为常规毛细管电泳技术。其中，当毛细管电泳为毛细管区带电泳时，原生质体悬液的浓度为IO7 IO9CFU/ mL ；ssDNA溶液的浓度为2 20 μ M ;药物溶液的浓度为O. 5 lOmmol/L ;将所述原生质体悬液和ssDNA溶液混合或将原生质体悬液和药物溶液混合得到毛细管区带电泳检测用样品。检测时，将样品转移至毛细管区带电泳进样瓶中，采用压力进样或电进样，使样品进入毛细管一端；然后加电压进行电泳，使样品在毛细管内移动并通过紫外检测器或荧光检测器；此时，在选定的波长下检测原生质体与ssDNA或药物的相互作用，可检测到明显复合物的产生，游离分子浓度降低，实现ssDNA或药物对原生质体的识别。当毛细管电泳为亲和毛细管电泳时，原生质体悬液的浓度为IO6 109CFU/mL ； ssDNA溶液的浓度为2 20 μ M ;药物溶液的浓度为O. 5 10mmol/L ；检测时，预先将原生质体悬液充满毛细管；采用压力进样，使ssDNA溶液或药物溶液进入毛细管一端；然后加电压进行电泳，在电泳的过程中ssDNA或药物会与原生质体发生相互作用；通过紫外检测器或荧光检测器可检测随着原生质体浓度的增大，ssDNA或药物出峰时间逐渐向后偏移，说明原生质体与ssDNA或药物发生了相互作用，偏移越大，作用越强；实现了 ssDNA或药物分子对原生质体的识别。紫外检测器检测时采用的紫外波长范围为180 600nm。激光诱导荧光检测器 (LIF)的激发波长为488nm或635nm，发射波长为520nm。当待检测的细菌原生质体为大肠杆菌原生质体或嗜酸乳杆菌的原生质体时，优选毛细管电泳缓冲液由硼酸根离子浓度为50mM，pH = 8. 7的硼酸-硼砂缓冲液与lmol/L的蔗糖溶液以体积比为I : I混合而成；ssDNA的核苷酸序列为人工合成的核苷酸序列5’-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG- (40N) -CCT ATGCGT GCT ACC GTG M-3’，即核苷酸序列表中数字标识符〈210〉所表示的序列标识符I所述的核苷酸序列，即核苷酸序列表中SEQ ID No. I ； 药物为表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或二苯乙烯苷。优选毛细管电泳所用毛细管的长度为30 100cm，内径为10 100 μ m。采用压力进样时的压力为500 25000Pa，进样3 30s ;采用电进样方式时，电进样条件为500 30KV，3 30s。加电压时的电泳电压O 30KV。有益效果I.本专利技术提供了，所述方法采用细菌的原生质体用于与ssDNA或药物相互作用，通过毛细管电泳进行检测，提供了一种简单、实用、快速和低成本检测细菌的新方法；2.本专利技术提供了，所述方法中采用细菌的原生质体作为检测对象，原生质体制备操作简单、成熟可靠且不需要复杂的前处理，由不同的细菌制备的原生质体具有专一的特性，对原生质体的识别即等同于对所述细菌的识别；采用原生质体作为检测对象可以克服用细菌作为检测对象时细胞壁的强屏蔽作用、作用位点少和作用强度弱等不利因素，原生质体暴露了细菌细胞膜上的各种酶及蛋白，大大增加了与ssDNA或药物相互作用的结合位点，ssDNA或药物更易与原生质体相互作用形成复合物，使检测的准确率更高，适用对象范围更广；3.本专利技术提供了本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：屈锋，孟朝阳，梅芳，古力，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：
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