一种细胞因子IL‑7的表达方法技术

本发明专利技术提供一种细胞因子IL‑7的表达方法，步骤如下：（1）构建IL‑7重组质粒pcDNA3.1‑IL7；（2）将重组质粒pcDNA3.1‑IL7转染HEK293细胞；（3）将转染后的细胞用含G418的高糖DMEM培养基继续培养，得到阳性单克隆细胞株；（4）将阳性单克隆细胞株进行培养，得到含有生长因子IL‑7的细胞上清。本发明专利技术应用人源细胞HEK293制备IL‑7，培养后，IL‑7的含量3.2ng/mL。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种细胞因子IL-7的表达方法。
技术介绍
Whitlock等在Witte-Whitlock骨髓培养中发现存在一种刺激pre-B和原B(pro-B)细胞生长的一种细胞因子。经研究发现，只有在含骨髓基质细胞系的培养基上培养时，pre-B细胞才能持续生长，而其他重组或天然细胞活性物质均无法替代骨髓基质细胞的作用。为进一步分析这种细胞因子，研究者们从培养基的基质成分中分离得到了一株单克隆细胞株，命名为IxN/A6，随后又从培养该细胞的上清溶液中分离纯化出了一种单链糖蛋白，此蛋白相对分子质量(Mr)大小为 25KD，是一种可溶性生长因子，起先命名为淋巴细胞生成素-1(Lymphopoiotin-1，Lp-1)，后又改称为IL-7。在首次发现时，IL-7被当作是一种促进pre-B和原B(pro-B)细胞生长的一种细胞因子，后来通过研究发现，其还具有促进B、T细胞生长和抗凋亡的功能。它不仅是B细胞生长和pro-B细胞生存、分化、增殖的因子，而且还是T细胞生长、增殖所必需的细胞因子。在胸腺早期的分化、增殖与树突状细胞的发育、分化等方面，IL-7也起到了至关重要的作用。但IL-7对抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的杀伤活性并没有增强的作用，它首先从胸腺转移到外周血中，然后再诱导胸腺细胞或外周血淋巴细胞产生淋巴因子，激活并增强LAK 活性，CD8+亚群就是IL-7的主要效应细胞，而且IL-7还可以支持记忆CD8+T细胞稳态扩展和生存。IL-7可以促进骨髓组织生成，它是多潜能干细胞和髓样前体细胞的一种移动因子。IL-7不光能刺激髓样前体细胞和巨核细胞产生集落形成单位和血小板，使机体从环磷酰胺的免疫抑制中得以恢复，而且在较高浓度时，它还能诱导增强巨噬细胞的细胞毒活性，作为生成CTL细胞、NK细胞以及活化单核细胞的协同因子，诱导单核-巨噬细胞分泌各种细胞因子，促进炎性因子表达：如巨噬细胞炎症蛋白α（MIP-α）、MIP-β、IL-8及单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等。通过活化炎性细胞产生的大量致炎因子，不仅能够控制炎症过程各组分之间的相互反应，还能增强单核细胞源性炎性因子受体(Chemokinereceptors，CCR)如 CCR1、CCR2及 CCR5的表达。除此之外，IL-7在诱导免疫反应方面也发挥着非常重要的作用，它不仅可以诱导 I 型免疫反应，增加IFN-γ和 IL-2 的产生，同时还能够协同IL-12以诱导产生 IFN-γ和增殖T细胞。IL-7和转化生长因子β之间也具有相互调节的作用，是免疫调控机制中非常重要的一环。总之，IL-7具有非常广泛的免疫效应，它在机体免疫系统的正常发育和维持免疫功能等方面均发挥了不可替代的作用。IL-7 不仅能够促进T细胞的免疫重建，而且还能够诱导T细胞循环和BCL-2 表达的上调，这对拓宽循环T细胞受体库的多样性和持久性，增加CD4+和 CD8+T细胞的数量都具有积极的促进作用，从而明显改变了T细胞亚群的分布，而且对HIV抗原来说，扩增的T细胞还能够分泌IL-2与IFN-γ，具有很好的抗病毒功能。因此，IL-7能够逆转HIV 特异性T淋巴细胞在增殖、细胞因子的分泌和细胞功能的发挥等方面的缺陷，具有极大的临床研究价值。基因工程制备蛋白类药物是生物技术发展的必然趋势，相对与提取工艺具有生产批量自由、不受原料限制、安全可控、可修饰、易于纯化等优点。目前尚未公开应用基因工程的方法如何制备生长因子IL-7。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种细胞因子IL-7的表达方法，是利用人源化HEK293细胞来表达的。HEK293细胞是人源化细胞，相对于其他种属细胞而言，在蛋白后期纯化中，纯度要求要稍低，人源化蛋白残留对于人体而言，负面损害较低；用HEK293细胞表达外源蛋白，在羰基化、甲基化修饰以及三级结构、四级结构等方面更接近天然蛋白，蛋白活性和功能更接近天然蛋白。本专利技术提供一种细胞因子IL-7的表达方法，步骤如下：（1）构建IL-7重组质粒pcDNA3.1-IL7；（2）将重组质粒pcDNA3.1-IL7转染HEK293细胞；（3）将转染后的细胞用含G418的高糖DMEM培养基继续培养，得到阳性单克隆细胞株；（4）将阳性单克隆细胞株进行培养，得到含有生长因子IL-7的细胞上清。作为优选，在构建重组质粒时，在IL-7基因起始密码子ATG前加入一段序列GCCACC。作为优选，所述构建重组质粒的具体方法为：（1）在IL-7基因起始密码子ATG前加入一段序列GCCACC，之后将其克隆至pUC57载体上；（2）利用引物进行PCR扩增，所述引物为：YIL-7-F：CCGGAATTCCTCGAGGCCACCATGTTCCATGTTTCTTTTAGGYIL-7-R：ATAAGAATGCGGCCGCGGATCCCCCGGGTCAGTGTTCTTTAGT；（3）将扩增产物和pcDNA3.1载体分别双酶切和胶回收，用T4连接酶进行连接，转化至感受态细胞BL21，诱导表达后，得到重组质粒pcDNA3.1-IL7。作为优选，所述重组质粒pcDNA3.1-IL7的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.2。作为优选，步骤（3）中所述G418的浓度小于等于600μg/ml。作为优选，步骤（4）中所述培养是在含胎牛血清的DMEM培养基中进行培养，培养条件为37℃，50mL/L CO2，培养时间为2d。本专利技术应用人源细胞HEK293表达制备IL-7，培养后，IL-7的含量3.2ng/mL。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为pcDNA3.1-IL7重组质粒验证结果；其中，图1a为pcDNA3.1-IL7菌液PCR验证；M: 1kb plusDNA分子量Marker；1: 水的PCR产物；2-4: pcDNA3.1-IL7的PCR产物；图1b为pcDNA3.1-IL7重组质粒酶切鉴定；M: 1kb plusDNA分子量Marker；1-3: 重组质粒pcDNA3.1-IL7双酶切产物。图2为HEK293-IL7细胞与对照组细胞绿色荧光观察结果（100×）。其中，A,C: pcDNA3.1-IL7转染组24h；B,D: pcDNA3.1-IL7转染组48h；E,G: pcDNA3.1-EGFP对照组转染24h；F,H: pcDNA3.1-EGFP对照组转染48h。图3为HEK293-IL7-2G3细胞中基因的转录表达检测，其中，M：100bp DNA分子质量标准；1：克隆细胞实验组；2：对照组；3：水。图4为IL-7标准品的标准曲线及标准曲线方程。图5为IL-7蛋白的Western-blot分析。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。实施例11、获取目的基因从NCBI数据库中获取IL-7的核苷酸序列，结果如下所示：ATGTTCCATGTTTCTTTTAGGTATATCTTTGGACTTCCTCCCCTGATCCTTGTTCTGTTGCCAGTAGCA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞因子IL‑7的表达方法，其特征在于：步骤如下：（1）构建IL‑7重组质粒pcDNA3.1‑IL7；（2）将重组质粒pcDNA3.1‑IL7转染HEK293细胞；（3）将转染后的细胞用含G418的高糖DMEM培养基继续培养，得到阳性单克隆细胞株；（4）将阳性单克隆细胞株进行培养，得到含有生长因子IL‑7的细胞上清。

【技术特征摘要】
1.一种细胞因子IL-7的表达方法，其特征在于：步骤如下：（1）构建IL-7重组质粒pcDNA3.1-IL7；（2）将重组质粒pcDNA3.1-IL7转染HEK293细胞；（3）将转染后的细胞用含G418的高糖DMEM培养基继续培养，得到阳性单克隆细胞株；（4）将阳性单克隆细胞株进行培养，得到含有生长因子IL-7的细胞上清。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在构建重组质粒时，在IL-7基因起始密码子ATG前加入一段序列GCCACC。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述构建重组质粒的具体方法为：（1）在IL-7基因起始密码子ATG前加入一段序列GCCACC，之后将其克隆至pUC57载体上；（2）利用引物进行PCR扩增，所述引物为：YIL-7-F：CCGGAATTCCTCGAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯若飞，马忠仁，徐雷，李向茸，张海霞，令瑛，
申请(专利权)人：西北民族大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62