eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法技术

eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，设计针对目的位点基因组的guideRNA靶序列，并进行体外转录获得针对该基因的guideRNA；构建donor DNA重组质粒；将guideRNA及donor DNA重组质粒进行受精卵注射获得F0代小鼠，对F0代小鼠的基因型进行鉴定获得正确同源重组的阳性F0代小鼠；将F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠，对F1代小鼠的基因型进行鉴定获得正确同源重组的阳性F1代小鼠；F1中阳性转基因小鼠同胞交配产生F2代小鼠，经过筛选鉴定得到纯合子的转基因小鼠。本发明专利技术方法使GPR120表达细胞同时表达eGFP，从而在激光激发下辨别出GPR120阳性细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于转基因
，具体涉及一种eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法。
技术介绍
GPR120(G-protein coupled receptor 120；又名free fatty acid receptor 4，FFAR4)是脂肪酸受体家族一员，属于G蛋白偶联受体(GPCR)，可被长链脂肪酸激活，尤以n-3不饱和脂肪酸激活能力最强。GPR120在脑、垂体、肺、舌、胃肠、脂肪组织等许多组织表达，主要分布于胃肠多种内分泌细胞、脂肪细胞、巨噬细胞、成骨和破骨细胞以及味蕾细胞。GPR120激活可刺激GLP-1、CCK、GIP等胃肠激素分泌。美国一研究组于2010年发现GPR120可促进巨噬细胞由炎性M1表型向抗炎M2表型转化，减轻脂肪组织的炎症反应，改善脂肪细胞胰岛素敏感性，并促进脂肪细胞摄取葡萄糖，从而明确了GPR120抗炎和增强机体胰岛素敏感性的作用。另有报道GPR120参与调节胰岛的胰高血糖素以及生长抑素分泌，起到一定的血糖调控作用。对欧洲人群GPR120基因进行大规模样本分析发现，人GPR120L R270H失功能性基因突变与肥胖显著正相关，并且与空腹血糖水平升高显著正相关，与胰岛功能降低相关，这提示GPR120功能异常可影响血糖水平，促进肥胖的发生。GPR120有望成为治疗肥胖和2型糖尿病的药物开发的有效靶点。目前关于GPR120生理和病理学作用的分子机制研究还十分有限，这主要是由于GPR120细胞分布较为分散，数量较少，难以获得分离纯化用于体外功能分析。例如胃肠道GPR120阳性细胞大多单个地夹在上皮细胞之间，所占比例极小，目前无法从中获得纯化的GPR120细胞。建立良好的GPR120阳性细胞标记模型，易化GPR120的分离纯化，这将极大推进有关GPR120生理和病理学作用的研究。目前用于活细胞标记和分离的方法有流式抗体标记、质粒转染标记等，这些方法存在的主要问题是假阳性标记、抗体消耗成本大、组间操作差异大、标记成功率变化大等。建立一个更为稳定的、简便的GPR120阳性细胞标记的方法十分必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，该方法可以使GPR120表达细胞同时表达eGFP，从而可以在激光激发下辨别出GPR120阳性细胞。本专利技术所采用的技术方案是，eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，具体步骤如下：步骤1，设计针对目的位点基因组的guideRNA靶序列，并根据序列将其进行体外转录获得针对该基因的guideRNA；步骤2，构建用于目的片段重组的donor DNA重组质粒；步骤3，将体外转录的guideRNA及构建的donor DNA重组质粒进行受精卵注射，获得F0代小鼠，通过长片段PCR的方式，对F0代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认，获得正确同源重组的阳性F0代小鼠；步骤4，将F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠，通过长片段PCR的方式，对F1代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认，获得正确同源重组的阳性F1代小鼠；步骤5，F1中阳性转基因小鼠同胞交配产生F2代小鼠，经过筛选鉴定之后，得到纯合子的转基因小鼠，并用纯合子来保存育种。本专利技术的特点还在于，步骤1中guideRNA序列如SEQ ID No.1所示。步骤2中donor DNA重组质粒的序列如SEQ ID No.2所示。步骤2中donor DNA重组质粒的构建方法如下：首先，PCR扩增克隆四个片段：5’同源臂片段、IRES-gfp-ployA片段、3’同源臂片段、载体片段；5’同源臂端所用引物是：上游引物：5’-GGG GAG AGA CGC GGC GGT GGG TCA CAG TCA AGC AAG-3’；下游引物：5’-GGG AGG GAG AGG GGC TTA GCT GGA AAT AAC AGA CAA GTC ATT-3’；IRES-gfp-ployA片段扩增用引物是：上游引物：5’-GCC CCT CTC CCT CCC CCC-3’；下游引物：5’-AAA GCA CTG AAC TAA CGA TAA GAT ACA TTG ATG AGT TTG GAC AAA C-3’；3’同源臂端所用引物是：上游引物：5’-TTA GTT CAG TGC TTT CGT AGA TTc tag cct ctg gtg Tca ggt gaa cc-3’；下游引物：5’-Aga atg aga cgc ggc TGG GGA AGT TTA GGG ATG GG -3’；载体扩增引物是：上游引物：5’-gcc gcg tct cat tcC TAC TGG GCG GTT TTA TGG AC-3’；下游引物：5’-gcc gcg tct ctc ccC GTA TAT CTG GCC CGT ACA TCG -3’；四个片段扩增的PCR反应体系和反应条件如下：PCR反应体系包括：去离子水11.7微升、5倍PCR Buffer 4微升、2.5mM dNTP 2微升、上游引物(10pmol/μl)0.5微升、下游引物(10pmol/μl)0.5微升、DNA聚合酶0.8微升、小鼠尾组织DNA模板0.5微升，合计20微升；反应条件是：第一步是95℃、2min，第二步是98℃、10sec，第三步是60℃、15sec，第四步是68℃、4min，第二步到第四步重复进行40次循环，随后一步是68℃、5min；反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后对PCR产物回收纯化，测定浓度，取四种PCR胶回产物各80ng，加入in-fusion 2ul，补水至10ul，置于50度15min，进行片段的连接；随后转化DH5a感受态进行克隆，挑取克隆，抽取DNA，酶切鉴定正确测序，收取正确质粒，用于后续受精卵注射。步骤3中F0代小鼠和步骤4中F1代小鼠5’同源臂和3’同源臂PCR鉴定用引物、反应体系和反应条件相同；5’同源臂PCR鉴定用引物序列如下：上游引物：5’-GCC ATA ATG CCG ATG AAC CC-3’；下游引物：5’-AAT CTA CGA AAG CAC TGA ACT AAC GA-3’；PCR反应体系包括：去离子水11.7微升、5倍PCR Buffer 4微升、2.5mM dNTP 2微升、上游引物(10pmol/μl)0.5微升、下游引物(10pmol/μl)0.5微升、DNA聚合酶0.8微升、小鼠尾组织DNA模板0.5微升，合计20微升；反应条件是：第一步是95℃、2min，第二步是98℃、10sec，第三步是60℃、15sec，第四步是68℃、4min，第二步到第四步重复进行40次循环，随后一步是68℃、5min；反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA扩增片段；5’臂同源重组阳性基因组应扩增出5.3kb片段，杂合子同时有6.7k产物，野生型基因组6.7k产物；3’同源臂PCR鉴定用引物序列如下：上游引物：5’-CTA CCT GAG CAC CCA GTC CG-3’；下游引物：5’-CCC CAC CTC CCC TAC CTT C-3’；反应条件是：第一步是95℃、2min，第二步是98℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1，设计针对目的位点基因组的guideRNA靶序列，并根据序列将其进行体外转录获得针对该基因的guideRNA；步骤2，构建用于目的片段重组的donor DNA重组质粒；步骤3，将体外转录的guideRNA及构建的donor DNA重组质粒进行受精卵注射，获得F0代小鼠，通过长片段PCR的方式，对F0代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认，获得正确同源重组的阳性F0代小鼠；步骤4，将F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠，通过长片段PCR的方式，对F1代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认，获得正确同源重组的阳性F1代小鼠；步骤5，F1中阳性转基因小鼠同胞交配产生F2代小鼠，经过筛选鉴定之后，得到纯合子的转基因小鼠，并用纯合子来保存育种。

【技术特征摘要】
1.eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1，设计针对目的位点基因组的guideRNA靶序列，并根据序列将其进行体外转录获得针对该基因的guideRNA；步骤2，构建用于目的片段重组的donor DNA重组质粒；步骤3，将体外转录的guideRNA及构建的donor DNA重组质粒进行受精卵注射，获得F0代小鼠，通过长片段PCR的方式，对F0代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认，获得正确同源重组的阳性F0代小鼠；步骤4，将F0代小鼠与野生型小鼠交配获得F1代小鼠，通过长片段PCR的方式，对F1代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认，获得正确同源重组的阳性F1代小鼠；步骤5，F1中阳性转基因小鼠同胞交配产生F2代小鼠，经过筛选鉴定之后，得到纯合子的转基因小鼠，并用纯合子来保存育种。2.根据权利要求1所述的eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤1中guideRNA序列如SEQ ID No.1所示。3.根据权利要求1所述的eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤2中donor DNA重组质粒的序列如SEQ ID No.2所示。4.根据权利要求1或3所述的eGFP标记GPR120阳性细胞的小鼠模型构建方法，其特征在于，步骤2中donor DNA重组质粒的构建方法如下：首先，PCR扩增克隆四个片段：5’同源臂片段、IRES-gfp-ployA片段、3’同源臂片段、载体片段；5’同源臂端所用引物是：上游引物：5’-GGG GAG AGA CGC GGC GGT GGG TCA CAG TCA AGC AAG-3’；下游引物：5’-GGG AGG GAG AGG GGC TTA GCT GGA AAT AAC AGA CAA GTC ATT-3’；IRES-gfp-ployA片段扩增用引物是：上游引物：5’-GCC CCT CTC CCT CCC CCC-3’；下游引物：5’-AAA GCA CTG AAC TAA CGA TAA GAT ACA TTG ATG AGT TTG GAC AAA C-3’；3’同源臂端所用引物是：上游引物：5’-TTA GTT CAG TGC TTT CGT AGA TTc tag cct ctg gtg Tca ggt gaa cc-3’；下游引物：5’-Aga atg aga cgc ggc TGG GGA AGT TTA GGG ATG GG-3’；载体扩增引物是：上游引物：5’-gcc gcg tct cat tcC TAC TGG GCG GTT TTA TGG AC-3’；下游引物：5’-gcc gcg tct ctc ccC GTA TAT CTG GCC CGT ACA TCG-3’；四个片段扩增的PCR反应体系和反应条件如下：PCR反应体系包括：去离子水11.7微升、5倍PCR Buffer 4微升、2.5mM dNTP 2微升、上游引物(10pmol/μl)0.5微升、下游引物(10pmol/μl)0.5微升、DNA聚合酶0.8微升、小鼠尾组织DNA模板0.5微升，合计20微升；反应条件是：第一步是95℃、2min，第二步是98℃、10sec，第三步是60℃、15sec，第四步是68℃、4min，第二步到第四步重复进行40次循环，随后一步是68℃、...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵玉峰，苏兴利，徐曦，闫爱丽，王莉，陈镝，谢荣，刘英光，
申请(专利权)人：西安医学院，
类型：发明
国别省市：陕西;61