【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用分子生物学技术,通过模拟天然香兰素合成途径来构建的一株大肠杆菌(以下简称代谢工程菌或者代谢工程大肠杆菌),及应用此代谢工程菌转化多种廉价的底物酪氨酸、葡萄糖、甘油或木糖生产香兰素的方法,属于生物
技术介绍
香兰素(Vanillin,4-羟基-3-甲氧基苯甲醛),又名香草醛,香荚兰素。香兰素主要存在于天然植物香荚兰中,香荚兰的豆荚中大约有2%干重的香兰素。香兰素被誉为“香料皇后”,是世界上产量最大,应用最为广泛的香料之一。香兰素具有独特香气,在食品、饮料、香精香料及医药领域中占据极为重要的地位。在化学工业中,香兰素还被用作镀锌槽的增白剂和锌电镀的活性剂,香兰素也是生产多巴和罂粟碱的基础原料。目前,全球对香兰素的年需求量已经超过了16,000吨。植物提取法和化学合成法是香兰素生产最为常用的两种方法。化学合成法是利用丁香酚、木质素、乙醛酸和愈创木酚等作为合成底物,其低廉的成本和简单的工艺使得这种方法生产的香兰素占据了绝大部分的市场(约90%)。然而,化学合成法会造成严重的环境污染,并且合成香兰素在纯度、香气和安全性等方面都远不及天然提取的香兰素,使得其价格远远低于天然香兰素。植物提取法是从香荚兰的豆荚中提取,种植区域的限制、气候的影响、高强度的体力劳动和较低的产率使得天然香兰素的产量远低于市场需求,导致天然香兰素价格及其昂贵,达到合成香兰素的300倍(高达4,000美元/公斤)。美国FDA规定,植物或动物原料通过物理、酶法或微生物转化得到的产品被认为是天然的产品。因此,温和的反应条件、简单的提取步骤、快速高效生产过程和清洁无污染等优 ...
【技术保护点】
一种代谢工程大肠杆菌的构建方法,其特征在于,所用基因元件为酪氨酸解氨酶基因、对香豆酸羟化酶基因、咖啡酸甲基转移酶基因、阿魏酰辅酶A合酶基因和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因。
【技术特征摘要】
1.一种代谢工程大肠杆菌的构建方法,其特征在于,所用基因元件为酪氨酸解氨酶基因、对香豆酸羟化酶基因、咖啡酸甲基转移酶基因、阿魏酰辅酶A合酶基因和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因。2.根据权利要求1所述的代谢工程大肠杆菌的构建方法,其特征在于,其所述酪氨酸解氨酶基因与SEQ ID NO.1的核苷酸序列杂交,并且编码具有酪氨酸解氨酶活性的蛋白质,其中所述酪氨酸解氨酶来源于西班牙糖丝菌;所述对香豆酸羟化酶基因与SEQ ID NO.2的核苷酸序列杂交,并且编码具有对香豆酸羟化酶活性的蛋白质,其中所述对香豆酸羟化酶来源于西班牙糖丝菌;所述咖啡酸甲基转移酶基因与SEQ ID NO.3的核苷酸序列杂交,并且编码具有咖啡酸甲基转移酶活性的蛋白质,其中所述咖啡酸甲基转移酶来源于拟南芥;所述阿魏酰辅酶A合酶基因与SEQ ID NO.4的核苷酸序列杂交,并且编码具有阿魏酰辅酶A合酶活性的蛋白质,其中所述阿魏酰辅酶A合酶来源于链霉菌V-1;所述烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因与SEQ ID NO.5的核苷酸序列杂交,并且编码具有烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶活性的蛋白质,其中所述烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶来源于链霉菌V-1。3.根据权利要求2所述的代谢工程大肠杆菌的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)利用PCR技术,以西班牙糖丝菌Saccharothrix espanaensis DSM 44229基因组为模板,扩增得到命名为sam8的酪氨酸解氨酶基因和命名为sam5的对香豆酸羟化酶基因;(2)利用内切酶分别对步骤(1)中得到的sam8基因片段和pACYCDuet-1质粒进行双酶切;(3)将步骤(2)中双酶切后的基因片段和pACYCDuet-1质粒用连接酶进行连接,构建重组质粒pACYCDuet-sam8;(4)利用内切酶分别对步骤(1)和(3)中得到的sam5基因片段和pACYCDuet-sam8质粒进行双酶切;(5)将步骤(4)中双酶切后的基因片段和pACYCDuet-sam8质粒用连接酶进行连接,构建重组质粒pACYCDuet-sam8-sam5;(6)根据大肠杆菌的密码子偏好性将拟南芥Arabidopsis thaliana中命名为comt的咖啡酸甲基转移酶基因进行密码子优化,并在前端加上T7启动子序列,用重组PCR的方法进行合成,并纯化;(7)利用内切酶分别对步骤(5)中得到的重组质粒和步骤(6)中得到的基因片段进行双酶切;(8)将步骤(7)中双酶切后的基因片段和质粒用连接酶进行连接,构建重组质粒pACYCDuet-sam8-sam5-comt;(9)利用PCR技术,以链霉菌Streptomyces sp.V-1保藏号为CCTCC M 206065基因组为模板,扩增得到命名为fcs的阿魏酰辅酶A合酶基因和命名为ech的烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶基因;(10)利用内切酶分别对步骤(9)中得到的ech基因片段和pETDuet-1质粒进行双酶切;(11)将步骤(10)中双酶切后的基因片段和pETDuet-1质粒...
【专利技术属性】
技术研发人员:许平,倪俊,陶飞,张兆斌,
申请(专利权)人:爱普香料集团股份有限公司,上海爱普植物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:上海;31
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