本发明专利技术公开了一种RNAi技术联合小剂量5-氨基酮戊酸（ALA）诱导肿瘤细胞原卟啉IX（PpIX）积聚的方法，是在外源性添加小剂量ALA的同时，利用RNAi基因沉默技术抑制亚铁螯合酶（FECH）的表达，从而使得外源性ALA所诱导产生的内源性PpIX能够更有效地积聚在肿瘤细胞。本发明专利技术还提供了上述RNAi所用的三个双链siRNA片段，对FECH具有很高的沉默效率。利用本发明专利技术的方法和双链siRNA片段，可在只使用小剂量外源性ALA的情况下，即可获得大量的PpIX并使其积聚在肿瘤细胞，实现肿瘤病灶的标示，尤其是对于早期肿瘤的标示，具有显著的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药
更具体地，涉及一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导 肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法。
技术介绍
癌症已成为威胁人类健康和生命的一大杀手，而癌症的发现往往都已处于中晚 期，约75%的患者就诊时肿瘤已到进展期，肿瘤已发生转移。而早期癌症病灶的发现对癌症 的治疗具有至关重要的意义，但是目前大部分癌症均缺乏早期症状及有效的诊断方法。 肿瘤选择性积聚原卟啉IX(PplX)已被证实伴随于成瘤过程的早期，可发生在有或 无外源性5-氨基酮戊酸(5-4111；[11016￥111；[11；[03(^(141^)诱导的情况下。研究发现，亚铁螯合 酶(FECH)可催化二价铁嵌入原卟啉IX(PpIX)生成血红素，而很多类型肿瘤的亚铁螯合酶 (FECH)活力较正常细胞为低，所以将PpIX转化为血红素减少，从而导致肿瘤组织中PpIX增 多，在此基础上，使用合适波长及能量的光源激发肿瘤内部蓄积的PpIX后，比较不同组织部 位的PpIX荧光含量及分布差异，就可发现早期微小癌灶。 目前，国内外一直采用大剂量外源性5-氨基酮戊酸（5-Aminolevulinic acid， ALA)的方式来增加肿瘤细胞内PpIX的合成量，以便标示肿瘤病灶。而因为部分肿瘤的FECH 活性并未明显降低，故能够将外源性ALA诱导产生的细胞内源性PpIX转化为血红素，从而使 PpIX迅速流失，因此该方式往往只能产生低浓度的肿瘤PpIX，必须使用更大剂量的ALA，才 能产生足够的PpIX在肿瘤组织积聚。采用大剂量使用5-氨基酮戊酸(ALA)的方式，不仅存在 上述的缺陷，而且大剂量的ALA用量还极易产生严重的全身尤其神经毒副作用。 专利技术人前期研究利用RNAi技术阻断FECH基因的表达，在此基础上辅小剂量的外源 性ALA，通过增加合成、减少去路的双重效能的方式以提高肿瘤细胞原卟啉IX积聚浓度，从 而改善了单用大剂量外源性ALA的模式难收集较高浓度的PpIX的方法上的不足。但是，在利 用RNAi技术阻断FECH表达的效能方面，目前所使用单段siRNA的方法仍有很大的改进空间， 虽然理论上使用单段siRNA可达到很高的基因敲减率，但是以我们多年的实际操作经验及 实验结果分析可知，实际工作中该方法一般只能达到约60~65%范围水平的基因敲减率， 因此，在此基础上辅以小剂量外源性ALA标示肿瘤病灶的效果不甚理想，尤其是针对早期病 灶的标示。 因提高RNAi技术阻断FECH表达的效能是提高肿瘤细胞PpIX积聚浓度的最关键的 环节，因此，探索更有效地提高对肿瘤细胞FECH基因的敲减率的方法，已成为此
中 的一项重大挑战。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有RNAi技术结合小剂量外源性ALA标示肿瘤病 灶技术的缺陷和不足，提供一种更有效的RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX 积聚的方法，该方法利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶(FECH)的表达，从而使得外源性ALA 所诱导产生的内源性PpIX能够更有效地积聚在肿瘤细胞，达到使用小剂量外源性ALA即可 有效标示肿瘤病灶的目的，提高肿瘤的检出率。 本专利技术的目的是提供一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的 方法。 本专利技术另一目的是提供上述方法中所使用的RNAi干扰序列及其在肿瘤诊断方面 的应用。 本专利技术上述目的通过以下技术方案实现： -种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法，是在外源性添 加小剂量ALA的同时，利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶FECH的表达，从而使得外源性ALA 所诱导产生的内源性PpIX能够更有效地积聚在肿瘤细胞;其中，所述利用RNAi技术沉默抑 制亚铁螯合酶FECH表达所用的双链siRNA的反义链的核苷酸序列与靶基因部分或全部互 补，双链siRNA的正义链与反义链部分或全部互补。 进一步地，所述沉默抑制亚铁螯合酶FECH的表达是利用双链740FECH-siRNA、 1072FECH-siRNA 和 3389FECH-siRNA 中的任一个或三者联用；所述 740FECH-siRNA、 1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的反义链的核苷酸序列分别与SEQ ID NO. 1所示序列的 740、1072、3389位开始的一段核苷酸序列互补；该段互补的核苷酸序列由18~29个连续的 核苷酸组成。优选地，所述该段互补的核苷酸序列由19~25个连续的核苷酸组成。更优选地，所述该段互补的核苷酸序列由19~23个连续的核苷酸组成。最优选地，所述该段互补的核苷酸序列由19个连续的核苷酸组成。另外，优选地，所述双链siRNA片段的两条链的3'端含有二核苷酸，而且这二核苷 酸最好是uu。 具体地，作为一种优选的实施方案，所述双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和 3389FECH-siRNA的核苷酸序列分别如SEQ ID从).2~7所示。即如下所示： (1)双链740FECH-siRNA 正义链740FECH-S1 (如SEQ ID 从).2所示）： 5，GCAGCUUAAAUGCCAUUUAUU 3,（第二条链）； 反义链740FECH-AS1 (如SEQ ID 从).3所示）： 3'UUCGUCGAAUUUACGGUAAAU 5'（第一条链，与SEQ ID N0.1 所示序列的740~758位 核苷酸互补）。（SEQ ID NO. 1所示序列的740~758位核苷酸：gcagcttaaatgccattta)。 (2)双链 1072FECH-siRNA 正义链 1072FECH-S2(如SEQ ID N0.4所示）： 5，GGUCCUCAAACAGACGAAUUU 3,（第二条链）； 反义链 1072FECH-AS2(如SEQ ID 从).5所示）： 3'UUCCAGGAGUUUGUCUGCUUA 5'（第一条链，与SEQ ID N0.1 所示序列的 1072~1090 位核苷酸互补）。（SEQ ID NO. 1所不序列的1072~1090位核苷酸：ggtcctcaaacagacgaat)。 (3)双链3389FECH-siRNA 正义链3389FECH-S3(如SEQ ID 从).6所示）： 5，CAGGCAAAGAGGAAUUUAUUU 3,（第二条链）； 反义链3389FECH-AS4(如SEQ ID N0.7所示）： 3，UUGUCCGUUUCUCCUUAAAUA 5,（第一条链，与与SEQ ID N0.1 所示序列的3389~ 340 7位核苷酸互补^(SEQ ID NO. 1所示序列的3 389~340 7位核苷酸： caggcaaagaggaatttat)〇 另外，进一步地，上述的添加小剂量ALA是指本专利技术所述之体外细胞实验中低于或 等于O.lmM的ALA浓度，或本专利技术所述之动物实验中低于或等于1毫克/公斤体重的ALA浓度。 另外，根据所述的内容，一种干扰抑制亚铁螯合酶FECH表达的双链siRNA也在本发 明的保护范围之内，所述双链siRNA为双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA中的任一个本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法，其特征在于，是在外源性添加小剂量ALA的同时，利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶FECH的表达，从而使得外源性ALA所诱导产生的内源性PpIX能够更有效地积聚在肿瘤细胞；其中，所述利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶FECH表达所用的双链siRNA的反义链的核苷酸序列与靶基因部分或全部互补，双链siRNA的正义链与反义链部分或全部互补。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：温嘉耀，
申请(专利权)人：温州医科大学，温嘉耀，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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