一种利用激光诱导肌红蛋白还原的方法技术

本发明专利技术属于生理学领域，具体涉及到生命体內肌红蛋白的还原过程，模拟体液环境下肌红蛋白与氧气的结合与分离，以及蛋白活性中心铁卟啉的结构的变化和电子转移的过程。本发明专利技术采用激光闪光光解、紫外‑可见、圆二色等多种光谱的方法研究肌红蛋白活性中心位点铁卟啉铁的价态和配位状态的变化。本发明专利技术的有益效果：本发明专利技术利用激光闪光光解技术研究氨基酸对肌红蛋白瞬态吸收以及其动力学过程的影响，发现游离氨基酸可以发挥与蛋白质中氨基酸不同的作用，对光激发肌红蛋白弛豫过程影响较大。这具有重要的生理学和医学意义，为光动力学治疗肌肉和血液疾病提供了新的可能，并且还可能为肉类产品的保鲜技术的发展提供新的思路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生理学领域，具体涉及到生命体内肌红蛋白的还原过程，模拟体液环境下肌红蛋白与氧气的结合与分离，以及蛋白活性中心铁卟啉的结构的变化和电子转移的过程。技术背景以血红素为辅基的蛋白质称为血红素蛋白(hemoproteins)，血红素蛋白可以催化一系列反应，从电子转移、小分子运输、传感，到氧活化反应。血红素辅基构成了这种蛋白的活性中心。血红素类蛋白在生物体内具有很多重要的功能，如存储和运输O2、电子转移、生物催化和小分子生物传感器(O2、NO和CO)等。由于肌红蛋白结构简单并且具有重要的生物活性，因此肌红蛋白(Myoglobin,Mb)成为研究蛋白动力学、蛋白结构变化以及蛋白与其他分子相互作用的模型蛋白。肌红蛋白(Mb)是由153个氨基酸环绕中央的血红素组成的单链蛋白质，由一条多肽链和一个血红素辅基构成，在体内与O2分子结合起着储存和促进氧气在生物体细胞中扩散的作用；它还能与CO和NO等小分子配体可逆结合，从而调控其它蛋白的生理功能。Mb活性中心的血红素Fe(Fe2+或Fe3+状态)有6个配位轨道，其中4个与卟啉环的N原子相连，第五配位与近端His93残基的咪唑氮结合，第六配位空置(DeoxyMb)或与小分子配体结合。血红素內Fe呈Fe2+状态时可以与小分子配体(如O2、CO等)配位结合，呈Fe3+状态时可以与水分子配体结合形成MetMb。色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)与半胱氨酸(Cys)的光学行为研究部分已报道在光化学与光物理上，色氨酸在近紫外区域有强烈地吸收，其次为酪氨酸，但蛋白质内部的氨基酸残基对近紫外光却无吸收。Hayon等利用激光闪光光解研究表明，光激发色氨酸形成单重激发态色氨酸并伴随两个无辐射弛豫通道：首先形成水和电子(e-aq)以及色氨酸阳离子自由基,Trp·+迅速转化为Trp·与H+(1-2),第二个是系间窜跃形成三重态3Trp.光激发酪氨酸后，经荧光发射、无辐射衰减或系间蹿越到激发三重态(3-4)。另外，在中性pH时酪氨酸从从三重态吸收第二个光子，通过双光子过程进行光电离反应生成水合电子与阳离子自由基并迅速去质子化(5-6)；在高pH时，形成中性自由基与水和电子(7)。Trp+hv→Trp·++e-aq(1)Trp·+→Trp·+H+(2)1Trp+hv→1Trp*(3)1Trp*→3Trp(4)3Tyr-OH+hv→Tyr-OH·++e-aq(5)Tyr-OH·+→Tyr-O·+H+(6)Tyr-O·-+hv→Tyr-O·+e-aq(7)自1980年代末以来光激发肌红蛋白的超快反应过程已成为研究对象，血红素的光循环过程仍是一个极具争议的问题，普遍认为光激发卟啉后有一个卟啉环电子向Fe的d轨道转移的过程。蛋白血红素辅基的双原子配体在一定程度上能够发生光解，因此，蛋白血红素Fe与配体结合与解离的动力学过程引起了很多研究学者的兴趣。Nienhaus等利用稳态和时间分辨技术对Myoglobin-CO的光化学行为进行了研究，表明蛋白质的配体解离后进入蛋白溶液过程涉及到特定的氨基酸残基，例如，远端组氨酸(His64)的旋转被指认为Myoglobin-CO光解后产生一瞬态物种的特征行为。Hochstrasser等以405nm激发，检测Q带(450–630nm)与band-Ⅲ谱带(730–900nm)区域，测量肌红蛋白Mb的瞬态动力学光谱。发现有两个超快电子弛豫步骤，一个小于100fs，另一个几乎为100fs，Mb均可以弛豫到电子基态(S0)。尽管氨基酸、肌红蛋白与配体结合解离的动力学过程已进行了部分研究,但氨基酸影响肌红蛋白的光学性质研究少有报道。关于光诱导高铁肌红蛋白(metmyoglobin,metMb)还原及其引起的蛋白结构变化方面的研究，国内尚未见报道，而国外文献报道大部分集中在利用外来电子供体或是光敏剂来进行还原反应。至今光诱导还原反应的详细机理尚不清楚，主要的困惑在于光诱导还原过程中电子供体的辨别。Bartocci等认为血红素轴向配体是电子供体，其提供的电子发生转移从而还原了血红素铁，而其他研究者则认为氨基酸残基，特别是色氨酸残基是光诱导还原反应的电子供体。总之，血红素蛋白光还原的机制及其波长的依赖性仍然没有得到很好的诠释。光动力学疗法(PhotodynamicTherapy，PDT)是近些年来发展起来的一种新型的物理化学治疗技术，其基本原理是光敏剂在特定波长光源的激发下进行能量的跃迁，随后将能量转移给生物体的氧，后者接受能量形成单线氧、自由基或自由基离子等，它们作用于靶细胞，引起病变细胞的凋亡，达到治疗疾病的目的。研究出光诱导肌红蛋白的还原过程，涉及到蛋白活性中心铁卟啉的结构的变化、电子转移及自由基中间态变化等过程，这与光动力学疗法有相似之处，这可能会为以后的光动力学治疗肌肉和血液疾病提供了新的可能。在我们的生活中，食品的保鲜尤其是肉类的防腐保鲜自古以来便是人们研究的重要课题。随着现代人生活方式的转变、生活节奏的加快以及健康饮食观念的加重，使得传统的肉类保鲜已无法满足人们的需求，因此就需要有新的技术的开发。肉类的腐败主要有三种因素引起：(1)微生物污染、生长繁殖；(2)脂肪氧化；(3)肌红蛋白变色。肌红蛋白的变色是由于肌红蛋白氧化所致的，而光诱导肌红蛋白的还原过程可能为肉类保鲜提供新的思路。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了推测出光诱导血红素蛋白还原反应的机理、光诱导还原过程中电子供体及电子转移的过程。为实现以上的技术目的，本专利技术将采取以下的技术方案：一种利用激光诱导肌红蛋白还原的方法，包括以下步骤：一、不同形态的肌红蛋白的制备与光谱数据的测定，包括的步骤：(1)配制一定量的高浓度(0.2mol/L)的PH＝7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液作为储备液，并于4℃的冰箱中避光保存，待用时稀释到0.05mol/L；(2)用配好的0.05mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液配制高浓度(10-4mol/L)的pH＝7.4的高铁肌红蛋白(MetMb)作为储备液，并于4℃的冰箱中避光保存，待用时再稀释到10-5mol/L；(3)用配好的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液将高铁肌红蛋白稀释成浓度为10-5mol/L的高铁肌红蛋白溶液，取2ml高铁肌红蛋白溶液于比色皿中，测其紫外-可见光谱，再向其中加入10μl、浓度为0.1mol/L的K3Fe(CN)6，直至达到MetMb：K3Fe(CN)6的摩尔比为1：100，待其完全反应后，再测定其紫外-可见光谱；(4)亚铁肌红蛋白(DeoxyMb)制备是利用将2ml的高铁肌红蛋白(浓度为10-5mol/L)进行还原，高铁肌红蛋白中加入8μl、浓度为0.1mol·L-1的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)溶液，直至达到MetMb：Na2S2O4的摩尔比达到1：40，将高铁肌红蛋白还原后，透析除去连二亚硫酸钠制得；(5)氧合肌红蛋白(MbO2)制备是利用将2ml的高铁肌红蛋白(浓度为10-5mol/L)进行还原，高铁肌红蛋白中加入8μl、浓度为0.1mol·L-1的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)溶液，直至达到MetMb：Na2S2O4的摩尔比达到1：40，将高铁肌红蛋白还原后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用激光诱导肌红蛋白还原的方法，其特征在于，包括以下步骤：一、不同形态的肌红蛋白的制备与光谱数据的测定，包括的步骤：(1)配制0.2mol/L的PH＝7.4的Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲溶液作为储备液，并于4℃的冰箱中避光保存，待用时稀释到0.05mol/L；(2)用配好的0.05mol/L的Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲溶液配制10‑4mol/L的pH＝7.4的高铁肌红蛋白作为储备液，并于4℃的冰箱中避光保存，待用时再稀释到10‑5mol/L；(3)用配好的Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲溶液将高铁肌红蛋白稀释成浓度为10‑5mol/L的高铁肌红蛋白溶液，取2ml高铁肌红蛋白溶液于比色皿中，测其紫外‑可见光谱，再向其中加入10μl、浓度为0.1mol/L的K3Fe(CN)6，直至达到高铁肌红蛋白溶液：K3Fe(CN)6的摩尔比为1：100，待其完全反应后，再测定其紫外‑可见光谱；(4)亚铁肌红蛋白制备是利用将2ml浓度为10‑5mol/L的高铁肌红蛋白溶液进行还原，高铁肌红蛋白溶液中加入8μl、浓度为0.1mol·L‑1的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)溶液，直至达到高铁肌红蛋白溶液：Na2S2O4的摩尔比达到1：40，将高铁肌红蛋白还原后，透析除去连二亚硫酸钠制得；(5)氧合肌红蛋白(MbO2)制备是利用将2ml浓度为10‑5mol/L的高铁肌红蛋白溶液进行还原，高铁肌红蛋白溶液中加入8μl、浓度为0.1mol·L‑1的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)溶液，直至达到高铁肌红蛋白溶液：Na2S2O4的摩尔比达到1：40，将高铁肌红蛋白还原后，通入过量的高纯氧气并透析除去连二亚硫酸钠制得；(6)高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白的紫外‑可见光谱的测定，测定条件为狭缝宽度为2nm，扫描波长范围220～700nm，扫描速率200nm·min‑1，响应时间中等，再向高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白中分别加入0.01mol/L的游离色氨酸Trp，达到摩尔比为高铁肌红蛋白：Trp＝1：1，分别测定高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白和氧合肌红蛋白的紫外‑可见光谱；(7)高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白的圆二色光谱的测定，测定条件为狭缝宽度1nm，扫描波长范围为190～250nm，扫描速率为50nm·min‑1，响应时间为2s，再向高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白中加入0.01mol/L的游离色氨酸，达到摩尔比为高铁肌红蛋白：Trp＝1：1，分别测定高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白和氧合肌红蛋白的圆二色光谱；二、激光诱导不同形态的肌红蛋白，包括的步骤：(1)激光还原高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白：在激光照射肌红蛋白溶液前，在室温20℃下，先通氮气以除去溶液中的溶氧，在室温条件下，激光照射高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白，所用的激发光(266nm)光源是Nd:YAG调Q激光器，探测光光源是450W氙灯，光谱采集时间范围为1000ns，波长范围为250‑800nm，通过L900软件将动力学吸收光谱转化为瞬态吸收光谱和动力学衰减曲线；(2)加入游离色氨酸后，激光还原向高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白：在高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白中加入0.01mol/L的游离色氨酸，达到摩尔比为高铁肌红蛋白：游离色氨酸＝1：1，激光照射肌红蛋白溶液前，在室温20℃下，激光照射高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白，先通氮气以除去溶液中的溶氧，在室温条件下，所用的激发光(266nm)光源是Nd:YAG调Q激光器，探测光光源是450W氙灯，光谱采集时间范围为1000ns，波长范围为250‑800nm，并通过L900软件将动力学吸收光谱转化为瞬态吸收光谱和动力学衰减曲线。...

【技术特征摘要】
1.一种利用激光诱导肌红蛋白还原的方法，其特征在于，包括以下步骤：一、不同形态的肌红蛋白的制备与光谱数据的测定，包括的步骤：(1)配制0.2mol/L的PH＝7.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液作为储备液，并于4℃的冰箱中避光保存，待用时稀释到0.05mol/L；(2)用配好的0.05mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液配制10-4mol/L的pH＝7.4的高铁肌红蛋白作为储备液，并于4℃的冰箱中避光保存，待用时再稀释到10-5mol/L；(3)用配好的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液将高铁肌红蛋白稀释成浓度为10-5mol/L的高铁肌红蛋白溶液，取2ml高铁肌红蛋白溶液于比色皿中，测其紫外-可见光谱，再向其中加入10μl、浓度为0.1mol/L的K3Fe(CN)6，直至达到高铁肌红蛋白溶液：K3Fe(CN)6的摩尔比为1：100，待其完全反应后，再测定其紫外-可见光谱；(4)亚铁肌红蛋白制备是利用将2ml浓度为10-5mol/L的高铁肌红蛋白溶液进行还原，高铁肌红蛋白溶液中加入8μl、浓度为0.1mol·L-1的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)溶液，直至达到高铁肌红蛋白溶液：Na2S2O4的摩尔比达到1：40，将高铁肌红蛋白还原后，透析除去连二亚硫酸钠制得；(5)氧合肌红蛋白(MbO2)制备是利用将2ml浓度为10-5mol/L的高铁肌红蛋白溶液进行还原，高铁肌红蛋白溶液中加入8μl、浓度为0.1mol·L-1的连二亚硫酸钠(Na2S2O4)溶液，直至达到高铁肌红蛋白溶液：Na2S2O4的摩尔比达到1：40，将高铁肌红蛋白还原后，通入过量的高纯氧气并透析除去连二亚硫酸钠制得；(6)高铁肌红蛋白、亚铁肌红蛋白、氧合肌红蛋白的紫外-可见光谱的测定，测定条件为狭缝宽度为2nm，扫描波长范围220～700nm，扫描速率200...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹洪玉，史飞，高凌星，郑学仿，唐乾，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21