一种β‑葡聚糖的结构分析方法技术

本发明专利技术提供了一种β‑葡聚糖的结构分析方法，包括以下步骤：(1)用碱性酒石酸铜溶液滴定法测出未处理样品的还原糖量x0；(2)用碱性酒石酸铜溶液滴定法测出淀粉酶处理后的样品的还原糖量x1；(3)用碱性酒石酸铜溶液滴定法测出蜗牛酶处理后的样品的还原糖量x2；(4)取待测样品溶于水，加入足量的高碘酸钠反应，反应完全后加入乙二醇破坏过量的高碘酸钠，测试溶液于223nm波长处的光密度，计算得到高碘酸的消耗量n1摩尔；(5)取步骤(4)得到的溶液，用氢氧化钠溶液滴定，计算得到甲酸释放量n2摩尔。通过计算，本发明专利技术能够用化学分析方法鉴别以1,3‑、1,6‑糖苷键链结和以1,3‑、1,4‑糖苷键链结的β‑葡聚糖。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及化学分析方法，尤其涉及β-葡聚糖的结构分析方法。
技术介绍
β-葡聚糖来源广泛，市场上β-葡聚糖主要来源为燕麦葡聚糖、真菌葡聚糖、海藻葡聚糖、酵母葡聚糖等。不同来源的β-葡聚糖结构不同，从而导致生物活性的不同。β-葡聚糖存在两种结构：一种是β-1,3-葡聚糖与β-1,4-葡聚糖的混合物，如燕麦β-葡聚糖；另一种是以1,3-糖苷键为主链、1,6-糖苷键为支链的β-葡聚糖，如真菌葡聚糖、海藻葡聚糖等。研究结果表明，由1,3-、1,6-糖苷键链结的β-葡聚糖具有抑制肿瘤、激活机体免疫、抗衰老、抗过敏、稳定肠道菌群等多重功能，效果远远超过了由1,3-、1,4-糖苷键链结的燕麦葡聚糖。因此，不同结构的β-葡聚糖功效差别很大，对其结构的检测显得尤为重要。目前，对于β-葡聚糖结构分析方法还没有统一的标准，现有的方法里主要是红外光谱、核磁共振等结合使用，利用谱图的数据分析得到相应结构。但是，红外光谱和核磁共振的相关设备昂贵，费用非常高，测定条件苛刻，对设备要求高，不适合一般实验室操作；并且，β-葡聚糖为大分子多糖结构，粘度大，溶解度不高，这直接影响到红外光谱以及核磁共振的测定结果，很难得到高清谱图，对解谱造成一定的困难。
技术实现思路
针对现有技术中的上述缺陷，本专利技术提供了一种β-葡聚糖的结构分析方法，能够用化学分析方法鉴别以1,3-、1,6-糖苷键链结的β-葡聚糖和以1,3-、1,4-糖苷键链结的β-葡聚糖。本专利技术的技术方案是：一种β-葡聚糖的结构分析方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取待测样品溶于水形成溶液，用碱性酒石酸铜溶液滴定法测出还原糖量x0；(2)取淀粉酶溶于水形成溶液，加入待测样品，反应完全后用碱性酒石酸铜溶液滴定法测出还原糖量x1；(3)取蜗牛酶溶于磷酸缓冲液形成溶液，加入待测样品，反应完全后用碱性酒石酸铜溶液滴定法测出还原糖量x2；(4)取待测样品溶于水，加入足量的高碘酸钠反应，反应完全后加入乙二醇破坏过量的高碘酸钠，测试溶液于223nm波长处的光密度，计算得到高碘酸的消耗量n1摩尔；(5)取步骤(4)得到的溶液，用氢氧化钠溶液滴定，计算得到甲酸释放量n2摩尔。淀粉酶是专一性水解1,4-糖苷键的酶；蜗牛酶是专一性水解1,3-糖苷键的酶。x0是未做处理的样品中的还原糖量，x1是通过淀粉酶水解后的样品中的还原糖量，x2是蜗牛酶水解后的样品中的还原糖量。当x1-x0≠0时，说明样品中存在1,4-糖苷键；当x2-x0≠0时，说明样品中存在1,3-糖苷键。通过测定水解后有无还原糖存在，可以判定样品是否存在1,4-糖苷键或1,3-糖苷键。高碘酸可选择性断裂糖分子中的邻二羟基或邻三羟基处,生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。反应定量进行,每开裂1个C—C键消耗1分子高碘酸。通过测定高碘酸的消耗量及甲酸的释放量,可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度、分支多糖的分支数等。将高碘酸氧化产物还原后酸水解，再鉴定水解产物，从而推断糖苷键的位置与分支点等。以葡萄糖为例，以1-2或1-4位键合的糖基经高碘酸氧化，平均每个糖基消耗1分子高碘酸，且无甲酸释放；1-3位键合的糖基不被高碘酸氧化；1-6位键合的糖基或非还原末端糖基经高碘酸氧化，消耗2分子高碘酸同时释放1分子甲酸。当n1＝2n2且均不为零时，说明高碘酸的消耗是甲酸生成的2倍，多糖中以1-6位键合的糖基或非还原末端基经高碘酸氧化，消耗2分子高碘酸同时释放1分子甲酸，由此可以推测，样品含有1,6-糖苷键。结合上述两个结论，可以鉴别被测β-葡聚糖样品是以1,3-、1,6-糖苷键链结还是以1,3-、1,4-糖苷键链结，进而鉴别β-葡聚糖的种类。进一步地，为了保证一定的水解速度和水解程度，上述步骤(2)的淀粉酶为100-300u/mg活性单位，步骤(3)的蜗牛酶为200-300u/mg活性单位。进一步地，为了使蜗牛酶产生有效的水解作用，上述步骤(3)的磷酸缓冲液的PH为7～8。进一步地，为了保证酶的活性和水解速度，上述步骤(2)和(3)的反应温度均为35℃～45℃。进一步地，上述步骤(1)～(3)中的碱性酒石酸铜溶液滴定法的滴定过程中溶液保持沸腾状态。沸腾的目的一是加快反应速度，二是防止次甲基兰与滴定过程中形成的氧化亚铜被氧气氧化，三是尽可能保证一致的实验环境，增加实验的平行性。进一步地，上述步骤(4)的光密度测试环境为20～35℃的避光处。光密度是指入射光与透射光的对数或者说是光线透过率倒数的对数，是检测方法里出现的专有名词。特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。因此，光密度值直接对应于检测物浓度，光密度值的准确与否直接决定了检测物的浓度，在室温下、无光线干扰的避光处测量，能够提高测量的准确性。进一步地，所述步骤(4)的反应完全指溶液于223nm波长处的光密度变化小于0.001/天。当光密度变化小于0.001/天时，可以认为光密度值达到一个稳定值，说明高碘酸的浓度不再发生变化，样品中1,6糖苷键已经反应完全。进一步地，所述步骤(5)的滴定过程中，采用的指示剂为溴甲酚蓝指示剂。进一步地，所述步骤(5)的反应过程中，溶液的PH值保持为3～5，以避免发生超氧化，且一定要在低温、避光处进行，以保证测试结果的准确性。本专利技术具有以下有益的技术效果：1)本专利技术能够用化学分析方法鉴别以1,3-、1,6-糖苷键链结的β-葡聚糖和以1,3-、1,4-糖苷键链结的β-葡聚糖；2)本专利技术具有可操作性强、仪器及试剂简单，成本低，不需要昂贵的测试仪器和苛刻的测试条件，也减少了复杂的解谱过程，适用性广；3)本专利技术减少了作为多糖大分子的β-葡聚糖的溶解性小、粘度高等性质对测试带来的误差，测量结果准确度高、相对标准偏差小、重现性好。【具体实施方式】以下结合具体实施例，对本专利技术做进一步描述。以下所提供的实施例并非用以限制本专利技术所涵盖的范围，所描述的步骤也不是用以限制其执行顺序。本领域技术人员结合现有公知常识对本专利技术做显而易见的改进，亦落入本专利技术要求的保护范围之内。实施例一一、本实施例涉及到的试剂及其配制如下：①0.1mol/LPH7～8磷酸缓冲液配制：称取4.644g无水磷酸二氢钠(NaH2PO4)和21.945g十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),置于烧杯中,加少量蒸馏水溶解.固体全部溶解后,将溶液转移到1000ml容量瓶中.用蒸馏水润洗溶解用的烧杯三次,润洗后的水也加入到容量瓶中,定容,即得。②碱性酒石酸铜甲液：称取15g硫酸铜(CuSO4·5H2O)及0.05g亚甲基蓝，溶于蒸馏水中并稀释到1000ml。③碱性酒石酸铜乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠(NaOH)，溶于蒸馏水中，再加入4g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6]，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。④0.1％葡萄糖标准溶液：准确称取1.000g经98～100℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000ml容量瓶中，加入5ml浓HCl(防止微生物生长)，用蒸馏水稀释到1000ml。⑤溴甲酚蓝指示剂：将0.12g溴甲酚蓝用250ml含有1.43毫升0.1mol/L氢氧化钠的蒸馏水溶解并定容至250ml；⑥30mmol/L高碘酸钠溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β‑葡聚糖的结构分析方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取待测样品溶于水形成溶液，用碱性酒石酸铜溶液滴定法测出还原糖量x0；(2)取淀粉酶溶于水形成溶液，加入待测样品，反应完全后用碱性酒石酸铜溶液滴定法测出还原糖量x1；(3)取蜗牛酶溶于磷酸缓冲液形成溶液，加入待测样品，反应完全后用碱性酒石酸铜溶液滴定法测出还原糖量x2；(4)取待测样品溶于水，加入足量的高碘酸钠反应，反应完全后加入乙二醇破坏过量的高碘酸钠，测试溶液于223nm波长处的光密度，计算得到高碘酸的消耗量n1摩尔；(5)取步骤(4)得到的溶液，用氢氧化钠溶液滴定，计算得到甲酸释放量n2摩尔。

【技术特征摘要】
1.一种β-葡聚糖的结构分析方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取待测样品溶于水形成溶液，用碱性酒石酸铜溶液滴定法测出还原糖量x0；(2)取淀粉酶溶于水形成溶液，加入待测样品，反应完全后用碱性酒石酸铜溶液滴定法测出还原糖量x1；(3)取蜗牛酶溶于磷酸缓冲液形成溶液，加入待测样品，反应完全后用碱性酒石酸铜溶液滴定法测出还原糖量x2；(4)取待测样品溶于水，加入足量的高碘酸钠反应，反应完全后加入乙二醇破坏过量的高碘酸钠，测试溶液于223nm波长处的光密度，计算得到高碘酸的消耗量n1摩尔；(5)取步骤(4)得到的溶液，用氢氧化钠溶液滴定，计算得到甲酸释放量n2摩尔。2.根据权利要求1所述的β-葡聚糖的结构分析方法，其特征在于，所述步骤(2)的淀粉酶为100-300u/mg活性单位。3.根据权利要求1所述的β-葡聚糖的结构分析方法，其特征在于，所述步骤(3)的蜗牛酶为200-300u/mg活性单位。4.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾艳，
申请(专利权)人：宁波希诺亚海洋生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33