一种高度浓缩的凝乳酶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高度浓缩的凝乳酶及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1)取保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌BD3526发酵液上清，经硫酸铵沉淀法获得沉淀物加入CaCl2溶液溶解，即得粗凝乳酶液；2)将所得粗凝乳酶液装入透析袋中进行透析，透析液是CaCl2溶液；3)透析结束后，将透析袋中的溶液进行真空冷冻干燥，所得到的酶制剂即为高度浓缩的凝乳酶。该制备方法简单易行，便于实际操作，且实施效果显著，有效提高了凝乳酶活保留率，极大提高了对类芽孢杆菌产凝乳酶活力的保护，得到的高度浓缩的凝乳酶的纯度和酶活满足了产业化需求，为类芽孢杆菌发酵制备的凝乳酶制剂在工业化中的应用提供了可能性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种高度浓缩的凝乳酶及其制备方法。
技术介绍
微生物来源的凝乳酶以其产量大、成本较低、方便提取、经济效益高的优势，越来越广泛的应用于干酪工业化生产。国外一些公司已利用改良的菌种生产出高活力的凝乳酶，创造了巨大的经济效益，而我国干酪生产中使用的凝乳酶绝大部分尚依赖进口。目前，国内虽然已筛选出了大量不同来源的高产凝乳酶的菌株、优化菌种发酵条件及浓缩条件，并相关酶学性质分析等研究，然而在凝乳酶浓缩过程中发现其稳定性差，半衰期短，快速失活等问题，部分凝乳酶的工业应用受到限制。此外有研究报道，由细菌产生的中性蛋白酶存在自身降解的现象，易导致酶活降低甚至消失，对凝乳酶后续高度浓缩、保存及生产应用带来困难。因此提高酶的稳定性，保证凝乳酶在高度浓缩后仍维持较高酶活力，是扩大酶的应用范围的前提。中国专利申请(CN10374061)公开的类芽孢杆菌属的一个新菌种Paenibacillusdamxungensissp.nov.(保藏编号为：CGMCCNo.8333)，该菌株发酵液上清具有一定的凝乳活力。在中国专利申请(CN103865842A)中公开了类芽孢杆菌BD3526菌株发酵产物的凝乳酶活性，通过麸皮培养基培养的BD3526发酵液上清中酶活很高，达到2660.6SU/mL，然而将该菌株发酵液上清中提取的粗酶液经过沉淀透析后发现，所得金属蛋白酶快速失活，无法同时满足高纯度、高酶活的品质，从而无法被有效利用，进而严重限制了其在工业化中的应用。急需一种方法，能在粗酶液浓缩时有效保存金属蛋白酶的酶活力，从而得到纯度高，酶活高适于产业化应用的凝乳酶。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有的来自于BD3526发酵液上清中高酶活的凝乳酶(即一种金属蛋白酶)经沉淀透析后快速失活，从而无法得到高纯度，高酶活的凝乳酶的问题，提供了一种高度浓缩的凝乳酶及其制备方法，该制备方法能够有效地在高度浓缩过程中保护凝乳酶的活力，并最终得到一种高度浓缩的凝乳酶，该高度浓缩的凝乳酶保留有较高的酶活力。本专利技术人经过广泛的研究和反复的试验，发现在高度浓缩分离过程中通过改变类芽孢杆菌BD3526所产凝乳酶液中钙离子浓度，能够在高度浓缩过程中保护凝乳酶的活力，进而得到一种高度浓缩的具有凝乳功能的金属蛋白酶(即高度浓缩的凝乳酶)，使其酶活在高纯度下仍维持较高水平，从而完成了本专利技术。为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案之一是，一种高度浓缩的凝乳酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1)取保藏编号为CGMCCNo.8333的类芽孢杆菌BD3526发酵液上清，经硫酸铵沉淀法获得沉淀物，加入CaCl2溶液溶解，即为粗凝乳酶液；2)将步骤1)中所得粗凝乳酶液装入透析袋中，进行透析，透析液是CaCl2溶液；3)透析结束后，将透析袋中的溶液进行真空冷冻干燥，所得到的酶制剂即为高度浓缩的凝乳酶。其中，本专利技术步骤1)中保藏编号为CGMCCNo.8333的类芽孢杆菌BD3526发酵液上清由本领域常规方法得到，较佳地为类芽孢杆菌BD3526接种于麸皮培养基培养所得发酵液经离心得到，所述麸皮培养基较佳地包括小麦麸皮和水，其中小麦麸皮的含量较佳的为1％-14％，更佳的为2％-5％，最佳的为3％，所述百分比为质量百分比。所述类芽孢杆菌BD3526的接种量较佳的为0.4-3.2％，所述百分比为质量百分比。本专利技术所述麸皮培养基的主要成分较佳地为：蛋白质13.9-18.6％，脂肪3.3-8.2％，总碳水化合物61.9-74.62％，水分4.8-18.02％，灰分3.38-6.50％，所述百分比为质量百分比(详见公开号为CN103865842A的中国专利申请)。所述由麸皮培养基培养培养条件为常规培养条件(详见公开号为CN103865842A的中国专利申请)，较佳地采用摇床震荡培养，震荡速度较佳的为160r/min-180r/min，培养温度较佳的为20℃-40℃，更佳的为25℃-35℃，最佳的为35℃，培养时间较佳的为24-72小时(h)，最佳的为48小时。本专利技术步骤1)中所述硫酸铵沉淀法为常规的，所述的硫酸铵沉淀法较佳地包括以下步骤：将硫酸铵加入步骤1)所述的发酵液上清中，至硫酸铵的浓度达到饱和度为50-75％，混合后离心收集沉淀物。所述的饱和度更佳的为60％。所述的硫酸铵沉淀法更佳地还包括在机械搅拌的情况下，加入硫酸铵粉末，最佳地为缓慢加入硫酸铵粉末。所述离心收集沉淀物的离心速度为常规的，较佳的为12000-20000g，更佳的为12000-15000g，最佳的为15000g，离心时间为5-25分钟(min)，更佳的为15分钟，离心温度为2-4℃。本专利技术步骤1)所述的CaCl2溶液为常规的，所述CaCl2溶液的浓度较佳的为2.5-100mmol/L，更佳的为50mmol/L。步骤1)较佳的还包括将所述沉淀物加入CaCl2溶液溶解所得的溶液离心去除不溶物的步骤，取上清液即为粗凝乳酶液。其中所述的离心是常规的，只要沉淀下不溶物即可。本专利技术步骤2)中所述的透析袋为常规的，较佳的为分子截流量为14kDa的透析袋。本专利技术步骤2)中所述的透析操作时间为常规，较佳的为1-12小时，均可保证较高纯度的凝乳酶，更佳的为4小时。本专利技术步骤2)所述的CaCl2溶液为常规的，所述CaCl2溶液的浓度较佳的为1-10mmol/L，更佳的为5mmol/L。为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案之二是，一种由本专利技术所述制备方法制得的凝乳酶。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：将类芽孢杆菌BD3526发酵制备的粗凝乳酶液在沉淀浓缩过程中，通过一直保持有充足的钙离子供给，可有效维持该凝乳酶在沉淀浓缩操作中的稳定性，提高了浓缩后的凝乳酶酶活保留率。本专利技术在常温保存状态下(较佳为4-25℃)，高度浓缩后的凝乳酶可长时间维持凝乳酶活力在较高水平，其凝乳酶活力保留率可保持在90％以上。本专利技术所述的高度浓缩凝乳酶制备工艺简单，酶活保护效果显著有效，能够较好的满足工业化生产对高纯度、高酶活的凝乳酶的需求，能够改变我国在干酪生产方面对国外进口产品依赖性。附图说明图1为Ca2+的添加对凝乳酶活力的影响。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高度浓缩的凝乳酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：1)取保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌BD3526发酵液上清，经硫酸铵沉淀法获得沉淀物，加入CaCl2溶液溶解，即得粗凝乳酶液；2)将步骤1)中所得粗凝乳酶液装入透析袋中，进行透析，透析液是CaCl2溶液；3)透析结束后，将透析袋中的溶液进行真空冷冻干燥，所得到的酶制剂即为高度浓缩的凝乳酶。

【技术特征摘要】
1.一种高度浓缩的凝乳酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包
括以下步骤：
1)取保藏编号为CGMCCNo.8333的类芽孢杆菌BD3526发酵液上清，
经硫酸铵沉淀法获得沉淀物，加入CaCl2溶液溶解，即得粗凝乳酶液；
2)将步骤1)中所得粗凝乳酶液装入透析袋中，进行透析，透析液是
CaCl2溶液；
3)透析结束后，将透析袋中的溶液进行真空冷冻干燥，所得到的酶制
剂即为高度浓缩的凝乳酶。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的发酵液
上清由类芽孢杆菌BD3526接种于麸皮培养基培养所得发酵液经离心得到。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的培养为震荡培
养。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的硫酸铵
沉淀法包括以下步骤：将硫酸铵加入步骤1)所述的发酵液上清中，至硫酸
铵的浓度达到饱和度为50-75％，混合后离心收集沉淀物。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的饱和...

【专利技术属性】
技术研发人员：杭锋，洪青，王钦博，陶源，刘振民，陈卫，
申请(专利权)人：光明乳业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31