重组细胞、以及异戊二烯的生产方法技术

本发明专利技术要解决的问题在于，提供一种用于由甲醇等生产异戊二烯的一系列的技术。提供一种重组细胞，其通过将编码异戊二烯合成酶的基因导入作为甲基营养菌的宿主细胞中而得到，该基因在所述宿主细胞内表达，所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。作为甲醛的固定化途径，优选选自丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径及木酮糖单磷酸途径中的至少1种C1碳同化途径。也提供一种使用了该重组细胞的异戊二烯的生产方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种能够由甲醇等生产异戊二烯的重组细胞、及使用该重组细胞的异 戊二烯的生产方法。
技术介绍
异戊二烯为合成聚异戊二烯的单体原料，特别是在轮胎业界中为重要的原材料。 近年来，由依赖于石油的基础化学品的生产工艺向来自植物资源等可再生资源的生产工艺 转换的技术的开发和实用化正在平稳地进行。关于异戊二烯，例如已知有以糖为原料的重 组大肠杆菌的生产技术（专利文献1、2、非专利文献1)。 另一方面，在C1化合物中，甲醇由合成气体等廉价地制造，所述合成气体为由天 然气体及生物质或城市垃圾等废弃物得到的一氧化碳、二氧化碳及氢的混合气体。天然气 体在化石资源中也大量地存在，且〇) 2的产生量比较少，因此，作为新一代能量源备受关注， 由现有的石油向天然气体的转移正在进行。甲醇在水中为可溶等、操作或贮藏容易、而且作 为微生物培养的碳源也适合。 甲基营养菌（Methylotroph)是指将分子内不具有C-C键的碳化合物、例如甲烧、 甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺等用作唯一的碳源、能量源的C1化合物利用性微生物的总称 名。被称为甲烷氧化菌（Methanotroph)、甲烷氧化细菌、甲醇利用性细菌、甲醇利用性酵母、 甲醇利用性微生物等的微生物全部属于甲基营养菌。 甲基营养菌在将甲醇转变为甲醛之后，进行以将甲醛转变为具有C-C键的有机物 的反应为主的代谢。如图1所示，作为经由甲醛的碳同化代谢途径，已知有丝氨酸途径、核 酮糖单磷酸途径（Rump途径）及木酮糖单磷酸途径（xuMP途径）。被分类为细菌的甲基营 养菌（甲基营养菌细菌）具有丝氨酸循环或Rump途径。另一方面，被分类为酵母的甲基营 养菌（甲基营养菌酵母）具有XuMP途径。 另外，甲基营养菌细菌根据甲醇要求性的不同，被分类为专性甲基营养菌 (obligate methylotroph)和可以利用其它碳化合物的兼性甲基营养菌（facultative methylotroph)〇 现有技术文献 专利文献 专利文献1 :国际公开第2009/076676号 专利文献2 :国际公开第2009/132220号 非专利文献 非专利文献 1 :Yang J.，et al.，PLoS0ne 2012, 7(4)，e33509
技术实现思路
专利技术所要解决的问题 关于来自可再生资源的生产工艺，其现有技术的大部分包含上述异戊二烯生产技 术，是依赖于有机物、特别是糖、甘油或油成分等并利用微生物的生产方法。但是，为了供应 来自石油的众多的基础化学品的世界生产量，就来自植物资源等的、现状可使用的糖质、甘 油或油成分的量而言，作为微生物的碳源必定不足。即，依赖于糖质或油成分的、利用微生 物的基础化学品的生产量在将来也是有限的。另外，这种工艺也有可能产生与食物的竞争。 作为上述甲基营养菌的应用例，可列举来自甲醇的SCP(单细胞蛋白（singlecell protein))、生物分解性塑料、氨基酸等的生产技术。但是，还没有出现被应用于制造异戊二 烯等来自石油的基础化学品的例子。如上所述，通用高分子材料制品中使用的单体化合物 目前全部依赖于石油，永久且廉价地供给与目前的石油品质相同的石油的可能性非常低， 当务之急是开发新的有效的代替工艺。需要说明的是，在确保用于利用微生物生产化学品 的碳源的目的下，也正在研宄对含有纤维素、半纤维素及木质素等的硬生物质进行糖化的 技术，但需要用于糖化的酶处理等，在成本方面存在很大的问题。 鉴于上述现状，本专利技术的目的在于，提供一种用于由甲醇等生产异戊二烯的一系 列的技术。 用于解决问题的技术方案 用于解决上述的问题的本专利技术的1个方式为一种重组细胞，其通过将编码异戊二 烯合成酶的基因导入宿主细胞中而得到，所述宿主细胞为甲基营养菌，该基因在所述宿主 细胞内表达，所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种 C1化合物生产异戊二烯。 异戊二稀合成酶（异戊二稀合成酶，isoprenesynthase)具有将作为异戊烯基二 磷酸（IPP)的异构体即二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP)转变为异戊二烯的作用。异戊烯基二 磷酸和二甲基烯丙基二磷酸间的结构转变中异戊烯基二磷酸异构酶进行催化。异戊烯基二 磷酸异构酶存在于全部的生物中。 而且，本方式的重组细胞，是通过将编码异戊二烯合成酶的基因导入宿主细胞中 而得到，所述宿主细胞为甲基营养菌，且该基因在所述宿主细胞内表达。而且，能够由选自 甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。本方式的重 组细胞可以将在细胞内合成的二甲基烯丙基二磷酸及异戊烯基二磷酸通过异戊二烯合成 酶的作用转变为异戊二烯。即，根据本方式的重组细胞，可以由所述的C1化合物生产异戊 二烯。 优选作为甲醛的固定化途径，包括选自丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径及木酮糖 单磷酸途径中的至少1种C1碳同化途径。 优选进一步导入编码3-己酮糖-6-磷酸合成酶的基因和编码6-磷酸-3-己酮糖 异构酶的基因，该基因在宿主细胞内表达。 根据所述的构成，基于核酮糖单磷酸途径的甲醛固定化能力被赋予或增强。 优选所述宿主细胞为细菌或酵母。 优选所述酵母毕赤酵母（Pichia)属、汉逊（Hansenula)酵母属或假丝酵母菌 (Candida)属。 用于解决同样问题的本专利技术的其它方式为一种重组细胞，其通过将下列基因导入 宿主细胞中而得到：赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因、赋予甲醛固定化能 力的基因和编码异戊二烯合成酶的基因，该基因在宿主细胞内表达，所述重组细胞能够由 选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种Cl化合物生产异戊二烯。 本方式的重组细胞通过将"赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因"、"赋 予甲醛固定化能力的基因"及"编码异戊二烯合成酶的基因"导入宿主细胞中而得到，这些 基因在宿主细胞内表达。而且，能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少 1种C1化合物生产异戊二烯。 即，由于本方式的重组细胞导入了"赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的 基因"和"赋予甲醛固定化能力的基因"，因此，具有与甲基营养菌同样的特性。而且，由于 导入有"编码异戊二烯合成酶的基因"，因此，可以在细胞内表达异戊二烯合成酶。其结果， 可以将在细胞内合成的异戊烯基二磷酸转变为异戊二烯。即，利用本方式的重组细胞，可以 由所述的C1化合物生产异戊二烯。 优选作为甲醛的固定化途径，包括选自丝氨酸途径、核酮糖单磷酸途径及木酮糖 单磷酸途径中的至少1种C1碳同化途径。 解决用于同样问题的本专利技术的其它方式为一种重组细胞，其通过将下列基因导入 具有核酮糖单磷酸途径的宿主细胞中：赋予将甲醇和/或甲酸转变为甲醛的功能的基因和 编码异戊二烯合成酶的基因，该基因在宿主细胞内表达，所述重组细胞能够由选自甲烷、甲 醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。 本方式相当于例如具有核酮糖单磷酸途径的非甲基营养菌为宿主细胞的实施方 式。 优选赋予将甲醇转变为甲醛的功能的基因为编码甲醇脱氢酶或醇氧化酶的基因， 赋予将甲酸转变为甲醛的功能的基因为编码甲醛脱氢酶的基因。 甲醇脱氢酶（methanol dehydrogenase)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组细胞，其通过将编码异戊二烯合成酶的基因导入宿主细胞中而得到，所述宿主细胞为甲基营养菌，该基因在所述宿主细胞内表达，所述重组细胞能够由选自甲烷、甲醇、甲胺、甲酸、甲醛及甲酰胺中的至少1种C1化合物生产异戊二烯。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：古谷昌弘，上西章太，岩佐航一郎，
申请(专利权)人：积水化学工业株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP