通过在低PH下发酵产生有机酸制造技术

本发明专利技术涉及遗传改造的微生物中有机酸的生物合成。更尤其是，本发明专利技术提供遗传改造的微生物，其在低pH下对有机酸特别耐受并且能够在低pH下通过发酵产生有机酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】通过在低PH下发酵产生有机酸 相关申请的交叉参考 该申请要求保护2012年9月14日提交的美国临时申请系列号61/701，293的优 先权。 专利
本专利技术是使用生物催化剂产生可再生化学原料的领域，已经遗传改造了所述生物 催化剂以增加其将可再生碳源转化成有用的化合物的能力。更尤其是，本专利技术提供使用遗 传修饰的生物催化剂从可再生碳源产生有机酸，如琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和乳酸的方 法。 专利技术背景 琥珀酸（为了简洁，本文中也称为"琥珀酸"）是在多种产品，包括动物饲料、增塑 剂、冷冻剂、聚合物、纤维和塑料，最特别的是聚琥珀酸丁酯（也称为"聚琥珀酸亚丁酯"、"聚 (琥珀酸亚丁酯）"和"PBS"）的制造中早已使用或可能使用的潜在大体积化学物。由琥珀 酸制备的许多聚合物以比来源于石油的其他聚合物，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚对苯 二甲酸乙二酯（PET)快得多的速率被生物降解。像这样，由琥珀酸制备的塑料是高度想要 的，因为它们在垃圾或其他堆肥环境中会更迅速地腐烂（Kunioka等，2009)。这种性质扩展 至许多其他聚合物和塑料，其中单体亚基是生物来源的化合物或其化学等同物，而不是正 常在活生物体中没有大量发现的石油化学来源的化合物。例如，来源于延胡索酸（延胡索 酸）、苹果酸（苹果酸）、己二酸（己二酸）、L-乳酸（L-乳酸）、D-乳酸（D-乳酸），和其他 天然发生的有机酸的聚合物均比堆肥环境中的许多石油化学来源的聚合物降解地更迅速。 像这样，为了人类的利益，期望利用由生物化学物（由活生物体制备和/或代谢的化学物） 制备的聚合物和塑料替换目前由石油化学物制备的聚合物和塑料。 当然，可以从石油制造许多生物化学物，如琥珀酸、延胡索酸，和己二酸，并且实际 上，目前使用的制备PBS和尼龙的方法（2012)使用石油来源的单体。然而，因为世界石油供 应是有限的，还期望开发通过从可再生碳源，如糖、糖聚合物、甘油、脂肪酸、二氧化碳、木质 素或生物量的任何其他形式或来源于生物量的废物发酵产生生物化学单体的材料和方法。 因此，期望开发从可再生生物资源制备生物可降解塑料的方法。 已经开发了若干方法用于通过发酵产生有机酸，例如通过乳杆菌 (Lactobacillus)、埃希氏菌（Escherichia)和芽抱杆菌（Bacillus)属的细菌产生L-乳 酸（Grabar等，2006 ;Patel等，2006)，通过丝状真菌米根霉（Rhizopus oryzea)产生 延胡索酸（Roa Engel等，2008)，通过遗传改造的大肠杆菌（Escherichia coli)或凝 结芽抱杆菌（Bacillus coagulans)产生 D-乳酸（Wang 等，2011 ;Jarboe 等，2010 ; Grabar等，2006)，通过遗传改造的大肠杆菌（E. coli)产生己二稀二酸（Niu等，2002)， 通过酵母（Saccharomyces)、克鲁维酵母（Kluyveromyces)、假丝酵母（Candida)和伊 萨酵母（Issatchenkia)属的多种遗传改造的酵母种产生L-乳酸（Zhang等，2011 ;US 7,049，108，US 7, 229, 805)，通过遗传改造的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)产 生苹果酸（US 2008/0090273)，和通过遗传改造的大肠杆菌、酿酒酵母、东方伊萨酵母 (Issatchenkia orientalis)和解脂耶氏酵母（Yarrowia Iipolytica)产生瑭泊酸（Zhang 等，2009a ;Zhang 等 2009b ;Jantama 等，2008a ;Jantama 等，2008b ;W0 2010/003728 ;W0 2008/128522 ;W0 2010/043197 ;W0 2012/103261 ;US2012/0015415)。 许多上述方法，包括基于细菌的所有那些使用不能在低pH下生长的生物体。如本 专利技术中所用，术语"低pH"定义为5. 6或更低的pH。当低pH不耐受的生物催化剂，如细菌 生物催化剂用于产生有机酸，如琥珀酸时，培养基的pH变成酸性的并且通过加入碱，一般 是钠、钾、铵、镁或钙的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或其混合物将pH维持在约5. 6至约7. 5。 因此，培养液中的有机酸以盐存在，并且大多数有机酸分子是带电荷的。荷电状态具有优点 和缺点。优点是荷电盐不轻易地穿过细胞膜弥散回到细胞内。缺点是有机酸的聚合化学或 其他进一步的化学用途一般需要有机酸的质子化形式（也称为"游离酸"），所以发酵产生 的盐需要可能昂贵的下游处理来提供游离的酸形式。像这样，在低PH(接近或更优选低于 有机酸的最低PKa的pH)下产生有机酸将是有利的，从而大多数分子处于游离酸状态。将 其他考虑因素放在一边，低PH发酵液处理较廉价以给出游离酸的纯制剂，因为必须分离的 平衡离子（如钠、钾、铵、镁、钙）少得多。然而，该方法遇到的问题至少在理论上是质子化 的酸比其各自的盐更疏水，所以所述质子化的酸更易于通过细胞膜的疏水脂双层弥散回到 细胞内（van Maris等，2004)。如果需要能量将有机酸泵出细胞，那么接着发生无效循环， 其会消耗细胞的资源远离想要的生物合成（van Maris等，2004)。 但是，存在通过在低pH发酵产生有机酸的方法。最有名且最古老的是通过黑曲 霉（Aspergillus niger)和相关种产生梓檬酸的方法（Papagianni, 2007)，尽管梓檬酸可 能是特例，因为质子化形式可能比一羧酸和二羧酸的质子化形式更极化。近期，已经开发了 方法用于通过多种酵母在pH下产生L-乳酸，并且这些酵母之一已经商业化，尽管还未揭示 是哪一种酵母（Aker 等，Session Abstract 170, Society for Industrial Microbiology Annual Meeting, July 24-28, 2011，New Orleans, LA, USA)。已经改造了 酿酒酵母菌株 以产生苹果酸，但是pH维持在5 (Zelle等，2008)。甚至更近期，已经遗传改造了酿酒酵 母、东方伊萨酵母（Issatchemkia orientalis)和解脂耶氏酵母菌株以在相对低的pH下 产生琥珀酸（W0 2008/128522 ;TO 2010/043197 ;US 2012/0040422 ;TO 2010/003728 ;W0 2011/023700 ;W0 2009/101180 ;W0 2012/038390 ;W0 2012/103261;和 US 2012/0015415)。 然而，当提及时，在这些现有技术专利申请中已经发表的滴度和产量相比于通过在中性pH 下操作的细菌产生系统获得的那些相对低，所以来自发表的酵母方法的滴度和产量足够的 高以与中性pH细菌方法竞争并不明显（Jantama等2008a ;Jantama等，2008b)。此外，如 本专利技术所公开，在从腐烂的甘蔗渣和其他环境中存在若干酵母菌株，其在低PH下比酿酒酵 母菌株更耐受琥珀酸和L-乳酸。 WO 2012/103261公开了已经本文档来自技高网...

【技术保护点】
遗传改造的酵母细胞，其中从磷酸烯醇丙酮酸到琥珀酸的氧化途径和还原途径必需的酶以足以用平衡方式运转所述氧化途径和所述还原途径的水平存在于细胞质中，使得琥珀酸在厌氧或微需氧条件下生产为发酵产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·R·约卡姆，S·多勒，J·G·佩罗，
申请(专利权)人：麦兰特公司，
类型：发明
国别省市：美国;US