在真核细胞中生产琥珀酸制造技术

本发明专利技术涉及在真核细胞中生产琥珀酸。本发明专利技术涉及包含下述核苷酸序列的选自酵母和丝状真菌的重组真核细胞，所述核苷酸序列编码催化延胡索酸转化成琥珀酸的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶。本发明专利技术还涉及生产琥珀酸的方法，其中使用根据本发明专利技术的真核细胞。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请是申请号为200880117129. 3的中国专利申请的分案申请，原申请是国际 申请PCT/EP2008/065583的中国国家阶段申请。
本专利技术涉及包含编码延胡索酸还原酶的核苷酸序列的重组真核细胞和使用所述 重组真核细胞生产琥珀酸的方法。
技术介绍
琥珀酸是大量化学品的潜在前体。例如，琥珀酸可以被转化为1，4-丁二醇（BD0)、 四氢呋喃和Y-丁酸内酯。衍生自琥珀酸的另一产物是通过连接琥珀酸和BD0制造的聚酯 聚合物。 琥珀酸主要通过丁烷氢化的石油化学方法生产。这些方法被认为对环境有害，并 且昂贵。琥珀酸的发酵生产可以是生产琥珀酸的一种有吸引力的替代性方法，其中可以使 用可再生的原料作为碳源。 已知大量不同的细菌如Escherichiacoli和瘤胃细菌Actinobacillus、 Anaerobiospirillum、Bacteroides、Mannheimia或Succinimonassp.能生产王虎I白酸。对 这些细菌菌株的代谢改造提高了琥珀酸产率和/或生产力，或者减少了副产物形成。W02007/061590公开了用于生产苹果酸和/或琥珀酸的丙酮酸脱羧酶阴性酵母， 用丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和苹果酸转运蛋白（MAE)对所 述酵母加以转化。 尽管琥珀的发酵生产有所改进，但是仍然需要用于发酵生产琥珀酸的改进的微生 物。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是用于生产琥珀酸的替代性微生物。 根据本专利技术用包含下述核苷酸序列的选自酵母和丝状真菌的重组真核细胞实现 了这一目的，所述核苷酸序列编码催化延胡索酸转化成琥珀酸的NAD(H)-依赖型延胡索酸 还原酶。 惊讶地发现，与野生型真核细胞生产的琥珀酸量相比，根据本专利技术的重组真核细 胞生产的琥珀酸的量有所提高。优选地，根据本专利技术的真核细胞与不包含编码NAD(H)_依 赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列的野生型真核细胞相比，生产至少1. 2、优选至少1. 5、 优选至少2倍的琥珀酸。 在本文中使用时，根据本专利技术的重组真核细胞被定义为下述细胞，所述细胞含有 天然不存在于真核细胞中的核苷酸序列或多肽，或所述细胞经天然不存在于真核细胞中的 核苷酸序列或多肽转化或遗传修饰，或者其含有内源核酸序列的额外的一个或多个拷贝。 野生型真核细胞在本文中被定义为重组细胞的亲本细胞。 编码催化延胡索酸转化成琥珀酸的NAD(H)_依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸 序列可以是异源或同源的核苷酸序列，或者编码已通过突变、断裂或缺失被进一步遗 传修饰的异源或同源的NAD⑶-依赖型延胡索酸还原酶。重组DNA技术是本领域公 知的，如Sambrook和Russel(2001)"MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rd edition),ColdSpringHarborLaboratoryPress中。 用于表示给定（重组）核酸或多肽分子和给定宿主生物或宿主细胞之间相互关系 时，术语"同源的"被理解为表示天然情况下所述核酸或多肽分子由相同物种的宿主细胞或 生物生产，优选由相同品种或菌株的宿主细胞或生物生产。 关于核酸0NA或RNA)或蛋白质使用时，术语"异源的"是指下述核酸或蛋白质，所 述核酸或蛋白质不作为其出现的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然存在， 或者存在于与其天然存在不同的细胞或基因组或DNA或RNA序列中的一个或多个位置中。 异源核酸或蛋白质对引入它的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或合成生产或重组 生产的。 根据本专利技术的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶使用NAD(H)作为辅助因子，其中大 部分真核细胞包含fadh2-依赖型延胡索酸还原酶，其中FADH2是辅助因子。发现：真核细 胞包含编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列是有利的，因为NAD(H)-依赖型 延胡索酸还原酶为细胞提供了将NAD(H)氧化为NAD+并影响细胞中氧化还原平衡的其它选 项。 优选地，细胞表达编码催化琥珀酸形成的酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列 优选地编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶，所述延胡索酸还原酶包含与SEQIDNO: 1和/ 或SEQIDN0:3和/或SEQIDN0:4和/或SEQIDN0:6的氨基酸序列具有至少40%、优 选地至少 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99% 序列同一性的氨基酸氨基酸序列。优选地，核苷酸序列编码包含SEQIDN0:1和/或SEQ IDN0:3和/或SEQIDN0:4和/或SEQIDN0:6的氨基酸序列的NAD(H)-依赖型延胡索 酸还原酶。 序列同一性在本文中被定义为通过比较序列测定的两条或更多条氨基酸（多肽 或蛋白质）序列或两条或更多条核酸（多核苷酸）序列之间的关系。通常，在比较的序列 的整个长度上比较序列同一性或相似性。在本领域中，"同一性"也表示氨基酸或核酸序列 之间的序列相关度，根据情况通过这类序列串之间的匹配测定。 测定同一性的优选方法被设计为在测试的序列之间给予最大匹配。测定同一性 和相似性的方法被编码于公众可获得的计算机程序中。测定两条序列之间同一性和相似 性的优选的计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN，公众可从NCBI和其它来源（BLAST Manual，Altschul，S.，等，NCBINLMNIHBethesda，MD20894)获得。使用BLASTP的氨基 酸序列比较的优选参数为缺口开放11. 0,缺口延伸1，Blosum62矩阵。 编码在本专利技术细胞中表达的酶的核苷酸序列也可以通过它们在中度杂交条件或 优选严格杂交条件下与编码SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4和/或SEQIDN0:6的NAD(H)依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列杂交的能力来定义。严格杂交条件在本文中 定义为下述条件：所述条件允许至少约25个、优选约50个核苷酸、75或100个、优选约200 或更多个核苷酸的核酸序列，在约65°C的温度下，在包含约1M盐的溶液（优选6xSSC(氯 化钠、柠檬酸钠））或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中杂交，以及在65°C下，在 包含约0. 1M或更少盐、优选0. 2xSSC的溶液或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液 中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10小时，以及优选地，洗涤进行至少进行1小 时，其中至少将洗涤溶液更换两次。这些条件通常会允许具有约90%或更多序列同一性的 序列的特异性杂交。 中度条件在本文中定义为下述条件，所述条件允许至少50个核苷酸、优选约200 或更多个核苷酸的核酸序列，在约45°C的温度下，在包含约1M盐的溶液（优选6xSSC)或 具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中杂交，以及在室温下，在包含约1M盐的溶液 (优选6xSSC)或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进 行，即至少进行10小时，以及优选地，洗涤进行至少1小时，其中至少将洗涤溶液更换两次。 这些条件通常会允许具有多达50%序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员应当 能够调整这些杂交条件，从而本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含下述核苷酸序列的选自酵母和丝状真菌的重组真核细胞，所述核苷酸序列编码催化延胡索酸转化成琥珀酸的NAD(H)‑依赖型延胡索酸还原酶。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：瑞内·维尔瓦尔，吴亮，罗波图斯·安东尼厄斯·戴维尔德，科尼利斯·玛丽亚·雅各布斯·沙吉，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL