一种固定化碳酸酐酶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种固定化碳酸酐酶及其制备方法，该固定化碳酸酐酶包括磁性纳米颗粒、富醛基复合材料以及碳酸酐酶；所述富醛基复合材料包裹在磁性纳米颗粒表面形成富醛基壳，所述富醛基壳的表面醛基与碳酸酐酶通过共价键结合。本发明专利技术采用共价键将磁性纳米颗粒载体和生物酶结合，获得的固定化碳酸酐酶，具有纳米级粒径，使得固定化酶在催化体系中的分散性优于微米级以上的固定化酶；具有超顺磁性，使得固定化酶的重复使用性、操作稳定性都优于游离的碳酸酐酶；使得固定化碳酸酐酶物理稳定性和化学稳定性都优于游离的碳酸酐酶，应用于工业生产能大幅提高生产效率，同时降低生物酶的使用成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于固相化酶
，具体涉及。
技术介绍
酶的固定化是指通过化学、物理、生物方法，利用载体将酶限制或束缚在特定区域内进行催化反应的一种酶工程技术。酶的固定化技术有利于酶回收及连续化运作从而降低生产成本，因此成为近年来酶工程领域最为活跃的研究重点之一。 磁性纳米颗粒是一种利于分离和再利用的固定化载体，在工业生产中应用广泛。目前磁性纳米颗粒载体主要通过壳聚糖和琼脂糖包裹磁性纳米核达到改性修饰的目的。然而这种方法制备的磁性纳米颗粒固定化载体，由于采用包埋作用将酶分子包埋于载体内部，导致酶的催化活性结构受到载体的阻碍，对酶活力会造成影响，和游离酶相比，活力大幅度降低。 碳酸酐酶，是广泛存在于生物体内的一种金属蛋白，能够高效催化二氧化碳水化和去水化反应。固定化的碳酸酐酶在环境保护、生物质能源、食品储存工业、生物医药等领域都有重要应用。目前碳酸酐酶的固定化，主要采用离子交换作用力、物理吸附力或包埋法等方法与微米级以上固相多孔性颗粒结合。其中，微米级以上固相多孔性颗粒尺寸过大，固定化酶分散性弱，影响外部传质阻力，导致催化效率低；离子交换作用力，结合的碳酸酐酶过少；物理吸附力，作用力过弱，结合不牢固，导致多次使用后生物酶流失，批次使用效果不稳定；包埋法，碳酸酐酶的活性位点受到载体的阻碍，影响内部传质阻力，导致催化效率低。
技术实现思路
专利技术目的:针对现有技术中存在的上述缺陷，本专利技术的目的是提供了一种固定化碳酸酐酶，采用共价键将如碳酸酐酶的生物酶与磁性纳米颗粒结合，形成固定化生物酶，具有酶催化效率高、生物酶不易脱落、操作稳定性高等特点。本专利技术的另一目的是提供一种上述固定化碳酸酐酶的制备方法。 技术方案:为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为:一种固定化碳酸酐酶，包括磁性纳米颗粒、富醛基复合材料以及碳酸酐酶；所述富醛基复合材料包裹在磁性纳米颗粒表面形成富醛基壳，所述富醛基壳的表面醛基与碳酸酐酶通过共价键结合；其中，磁性纳米颗粒平均粒径为5?30nm，富醛基壳的平均厚度为5?20nm。 所述磁性纳米颗粒为纳米铁氧化物或纳米钛氧化物。 所述富醛基复合材料包括两层，从内到外依次为硅烷交联剂层和多醛基化合物层。 所述碳酸酐酶为α型或β型碳酸酐酶。 所述固定化碳酸酐酶,每克固定化碳酸酐酶包含碳酸酐酶5(T300mg。 一种所述固定化碳酸酐酶的制备方法，包括以下步骤:1)制备磁性纳米颗粒； 2)取磁性纳米颗粒和硅烷交联剂均匀分散于有机溶剂中，低温低速搅拌，获得包覆有硅烷交联剂的磁性纳米颗粒；3)取包覆有硅烷交联剂的磁性纳米颗粒，均匀分散于多醛基化合物的弱碱性缓冲液中，去除缓冲液，获得醛基功能化的磁性纳米颗粒；4)取醛基功能化的磁性纳米颗粒，加入待固定化的碳酸酐酶溶液，搅拌混合进行共价交联反应，即制得固定化碳酸酐酶。 步骤2)中，所述的硅烷交联剂为氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷，所述有机溶剂为无水乙醇，将磁性纳米颗粒与硅烷交联剂超声分散后，再将分散液加入到有机溶剂中，搅拌分散，从而使分散液与有机溶剂充分混匀，采用磁性分离去除有机溶剂。 步骤3)中，所述的多醛基化合物为戊二醛、丁二醛或丙二醛，采用磁性分离去除有机溶剂。 步骤4)中，所述醛基功能化的磁性纳米颗粒与碳酸酐酶过共价键结合形成固定化碳酸酐酶；所述碳酸酐酶溶液浓度为f5mg/mL，碳酸酐酶与富醛基复合材料包裹的磁性纳米颗粒的质量比为1:2?10。 步骤4)中，所述共价交联反应条件为25?30°C，摇床混合2?5h，摇床转速为120?200r/min。 有益效果:与现有技术相比，本专利技术具有以下优点:I)本专利技术采用共价键将磁性纳米颗粒载体和生物酶结合，获得的固定化碳酸酐酶，具有纳米级粒径，使得固定化酶在催化体系中的分散性优于微米级以上的固定化酶。 2)本专利技术提供的固定化碳酸酐酶，具有超顺磁性，使得固定化酶的重复使用性、操作稳定性都优于游离的碳酸酐酶。 3)本专利技术提供的固定化碳酸酐酶，采用醛基功能化修饰的磁性纳米颗粒与碳酸酐酶通过共价键结合，使得固定化碳酸酐酶物理稳定性和化学稳定性都优于游离的碳酸酐酶，应用于工业生产能大幅提高生产效率，同时降低生物酶的使用成本。 【附图说明】 图1是固定化碳酸酐酶的结构示意图；图2是固定化碳酸酐酶存放于N-甲基二乙醇胺中的稳定性测试结果图。 图3是固定化碳酸酐酶与传统固定化碳酸酐酶的性能对比结果图。 【具体实施方式】 为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，一下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。 一种固定化碳酸酐酶，结构如图1所示，包括磁性纳米颗粒、富醛基复合材料以及碳酸酐酶。其中，磁性纳米颗粒，平均粒径为5?30nm，可为纳米铁氧化物或纳米钛氧化物，例如:Fe304、Fe203、Ti02，优选磁性和稳定性良好且成本较低的Fe3O4 ;富醛基复合材料，是指含有丰富醛基的复合材料，包裹在磁性纳米颗粒表面形成富醛基壳，其平均厚度为5?20nm，富醛基复合材料包括两层，从里到外依次为硅烷交联剂和多醛基化合物，硅烷交联剂，如氨丙基三乙氧基硅烷或氨丙基三甲氧基硅烷，多醛基化合物，如戊二醛、丁二醛或丙二醛；富醛基复合材料包裹在磁性纳米颗粒表面形成富醛基壳，其表面醛基与待固定化的酶通过共价键结合。 实施例1一种固定化碳酸酐酶制备方法，包括以下步骤:I)制备磁性纳米颗粒:采用化学共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米颗粒，控制平均粒径为10纳米。 2)制备包覆有硅烷交联剂的磁性纳米颗粒:将5g磁性纳米颗粒和5mL氨丙基三乙氧基硅烷加入到50mL无水乙醇中，220W超声分散30min后，30°C，200r/min,搅拌40h，得到均匀分散体系。磁性分离并用大量乙醇和双蒸水清洗颗粒，获得纯净的包覆有氨丙基三乙氧基硅烷的磁性纳米颗粒。 3)制备富醛基复合材料包裹的磁性Fe3O4纳米颗粒:取包覆有氨丙基三乙氧基硅烷的磁性纳米颗粒5g，分散于150mL含有5%戊二醛弱碱性磷酸钾盐缓冲溶液(50mmol/L pH7.(Γ8.5)中，超声分散30min后，25°C，150r/min，搅拌3h，使包覆有氨丙基三乙氧基硅烷的磁性纳米颗粒与戊二醛发生共价交联反应，形成醛基功能化的磁性纳米颗粒。磁性分离并清洗颗粒，获得纯净的富醛基复合材料包裹的磁性纳米颗粒。 4)制备富醛基复合材料包裹的磁性纳米固定化碳酸酐酶:取富醛基复合材料包裹的磁性纳米颗粒200mg，分散于1mL 2mg/mL的碳酸酐酶弱碱性磷酸钾盐缓冲溶液中(50mmol/L pH 7.0?8.5)，pH为8.0，30°C，摇床混合4h，摇床转速为120r/min。使富醛基复合材料包裹的磁性纳米颗粒与待固定化的碳酸酐酶通过共价键结合，即形成富醛基复合材料包裹的磁性纳米固定化碳酸酐酶。磁性分离并清洗颗粒，获得纯净的富醛基复合材料包裹的磁性纳米固定化碳酸酐酶。 将制备的固定化碳酸酐酶通过pH电极法测定催化活力，结果显示:固定化酶每克蛋白的单本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固定化碳酸酐酶，其特征在于：包括磁性纳米颗粒、富醛基复合材料以及碳酸酐酶；所述富醛基复合材料包裹在磁性纳米颗粒表面形成富醛基壳，所述富醛基壳的表面醛基与碳酸酐酶通过共价键结合；其中，磁性纳米颗粒平均粒径为5~30nm，富醛基壳的平均厚度为5~20nm。

【技术特征摘要】
1.一种固定化碳酸酐酶，其特征在于:包括磁性纳米颗粒、富醛基复合材料以及碳酸酐酶；所述富醛基复合材料包裹在磁性纳米颗粒表面形成富醛基壳，所述富醛基壳的表面醛基与碳酸酐酶通过共价键结合；其中，磁性纳米颗粒平均粒径为5?30nm，富醛基壳的平均厚度为5?20nm。2.根据权利要求1所述的固定化碳酸酐酶，其特征在于:所述磁性纳米颗粒为纳米铁氧化物或纳米钛氧化物。3.根据权利要求1所述的固定化碳酸酐酶，其特征在于:所述富醛基复合材料包括两层，从内到外依次为硅烷交联剂层和多醛基化合物层。4.根据权利要求1所述的固定化碳酸酐酶，其特征在于:所述碳酸酐酶为α型或β型碳酸酐酶。5.根据权利要求1所述的固定化碳酸酐酶，其特征在于:所述固定化碳酸酐酶，每克固定化碳酸酐酶包含碳酸酐酶5(T300mg。6.一种权利要求f 5任意一项所述固定化碳酸酐酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: O制备磁性纳米颗粒； 2)取磁性纳米颗粒和硅烷交联剂均匀分散于有机溶剂中，低温低速搅拌，获得包覆有硅烷交联剂的磁性纳米颗粒； 3)取包覆有硅烷交联剂的磁性纳米颗粒，均匀分散于多醛基化合物的弱碱性缓冲液中，去除缓冲...

【专利技术属性】
技术研发人员：祝俊，余允东，张敏，陈亭亭，龙辉，汪浩，周晓青，张燕，陈风义，
申请(专利权)人：上海立足生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31