本发明专利技术“黄瓜抗番木瓜环斑病毒病基因prsv的Indel标记及其应用，”涉及生物技术辅助育种领域。黄瓜番木瓜环斑病毒病(PRSV)抗性基因prsv紧密连锁的Indel标记，其特征在于：prsvInde2-F/prsvInde2-R:CTTCCCCATCATCATACATC/AAGCAGGAGAATGAAACAAC；所述Indel标记扩增的与黄瓜PRSV感病基因PRSV连锁的特征条带为176bp，核苷酸序列见Seq ID No.1；所述Indel标记扩增的与黄瓜PRSV抗病基因prsv连锁的特征条带为170bp，核苷酸序列见Seq ID No.2所示；采用本发明专利技术获得的Indel标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段判断其是否对PRSV具有抗性，该标记具有高效、限制少的优点，对选育抗PRSV的黄瓜育种材料提高了效率，缩短了育种周期。
【技术实现步骤摘要】
黄瓜抗番木瓜环斑病毒病基因prsv的Indel标记及其应用
本专利技术涉及生物技术辅助育种
，特别涉及一种黄瓜中抗番木瓜环斑病毒基因prsv的Indel标记及其在黄瓜育种材料选择中的应用。
技术介绍
病毒病是影响黄瓜生产的主要病害之一，病原种类繁多，难以防治。其中番木瓜环斑病毒(Papayaringspotvirus，PRSV)就是引起该病的一种主要病原。PRSV是一种以蚜虫传播为主的马铃薯Y病毒属病毒，一般在夏末秋初时传播较快，因为在这个时候携带病源蚜虫数量的增加大大提高了病毒的蔓延速率，一旦植株染上病毒病，一般可减产10％～20％，重者可达40％～50％，甚至绝产，而且严重降低了瓜类商品品质。目前，已经挖掘了一些抗PRSV的黄瓜种质资源，而且前人也利用了其中一些抗病材料对黄瓜PRSV抗性遗传规律及分子标记进行了初步研究，Wang等(1984)利用黄瓜抗病材料SurinamLocal和感病材料Wisconsin2757杂交得出PRSV-W受一对隐性基因prsv-1控制；Wai和Grumet(1995b)在TMG-1中发现PRSV抗性是由单显性基因PRSV-2决定的；随后，Wai等(1997)证实prsv-1和PRSV-2互为等位基因；张海英等(2005)以感病亲本自交系欧洲八号、抗病亲本自交系秋棚构建的RILs群体为材料，对PRSV-W进行了抗病性鉴定，研究表明抗病性状是受隐性单基因控制的，但同时也存在微效基因的修饰。目前报道的与PRSV抗性相关的遗传连锁标记有AFLP、RAPD标记，但是这些标记与抗病基因连锁距离较远，且尚未将其定位在染色体上。专利
技术实现思路
本专利技术基于上述领域的不足，提供了与黄瓜中抗PRSV基因prsv紧密连锁的Indel标记，并提供了该标记在筛选对PRSV抗感的黄瓜种质资源上的应用。本专利技术的技术方案如下：一种与黄瓜中抗番木瓜环斑病毒基因prsv连锁的Indel标记，其特征在于：所述标记的引物的核苷酸序列如下：prsvInde2-F/prsvInde2-R：CTTCCCCATCATCATACATC/AAGCAGGAGAATGAAACAAC；所述引物扩增的与黄瓜中感番木瓜环斑病毒基因PRSV连锁的特征条带为176bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示；所述引物扩增的与黄瓜中抗番木瓜环斑病毒基因prsv连锁的特征条带为170bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。所述Indel标记在筛选具有抗番木瓜环斑病毒基因prsv的黄瓜种质资源中的应用，其步骤如下：(1)采用上述Indel标记的引物对待选黄瓜材料的基因组DNA分别进行PCR扩增；(2)对扩增结果进行凝胶电泳检测；(3)从检测结果中筛选出现与抗番木瓜环斑病毒基因prsv连锁的Indel标记特征条带一致的材料。所述PCR扩增的反应体系为:1.5ng/ulDNA模板，所述引物正向和反向各5ng/ul，0.5μL/ulGoGreenMasterMix，其余为双蒸水。所述PCR扩增的程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。所述凝胶电泳检测，指采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离，最后银染显色。本专利技术以感PRSV高代自交系65G与抗PRSV高代自交系02245为亲本构建F1、F2群体及F2:3家系，通过苗期人工接种鉴定和ELISA检测，对黄瓜PRSV抗性基因prsv进行了遗传规律分析。以F2群体为作图材料，利用BSA法和SSR及Indel标记技术，实现prsv基因在染色体上的遗传定位，并获得紧密连锁的Indel标记prsvIndel2，与prsv的遗传距离为1.6cM。所述Indel标记扩增的与黄瓜PRSV感病基因PRSV连锁的特征条带为176bp，核苷酸序列如SeqIDNo.1；所述Indel标记扩增的与黄瓜PRSV抗病基因prsv连锁的特征条带为170bp，核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。本专利技术通过利用35份不同遗传背景的黄瓜资源进行验证，结果表明prsvIndel2验证的正确率为85.7％，而对其中的24份抗性材料验证的正确率高达95.8％。本试验不仅为黄瓜抗PRSV基因prsv的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育具有抗PRSV基因的黄瓜新品种提供了高效途径。本专利技术基于开发的Indel标记引物提供用于辅助筛选具有特定PRSV抗性的黄瓜新品种的方法，该方法中，采用Indel标记引物扩增待测材料的DNA，然后对扩增产物进行电泳检测，扩增产物可能出现三种情况：第一种是仅仅出现一条170bp条带，这种为隐型纯合材料(抗PRSV)；另一种是170bp条带和176bp条带都出现，这种是显性杂合材料(感PRSV)；第三种是仅仅出现176bp条带，这种为显性纯合材料(感PRSV)。通过本专利技术提供的方法，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行PRSV抗性鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。附图说明图1.是用prsvIndel2标记验证黄瓜亲本材料65G(P1)、02245(P2)、F1以及F2群体随机单株的部分电泳检测结果；其中，P1：65G(感PRSV)；P2:02245(抗PRSV)；红色字体对应的泳道为表型与标记条带验证不一致的单株。图2.是prsvIndel2标记验证35份不同遗传背景的黄瓜材料的电泳检测结果；红色字体对应的泳道为表型与标记条带验证不一致的单株。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步的详细说明，但并不限制本专利技术的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。生物材料的来源和记载出处本研究所用的试验材料为黄瓜高代自交系65G和02245。以65G为母本，228为父本杂交，获得F1，自交获得F2群体及F2:3家系。黄瓜高代自交系65G(P1)：由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的欧洲温室型黄瓜雌性系，生长势强，连续座果多，瓜长20多厘米，表面光滑无刺瘤，无苦味，抗黑星病，感番木瓜环斑病毒病(PRSV)。为现有已知品种，在顾兴芳等人于2006年在《园艺学报》第3期第690页上发表的文章《黄瓜新品种‘中农19号’》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。黄瓜高代自交系02245(P2)：由中国农业科学院蔬菜花卉研究所选育的露地耐热抗病自交系，华北型黄瓜，耐热性突出，分枝性强，腰瓜长约35厘米，刺瘤密，抗番木瓜环斑病毒病(PRSV)，抗霜霉病，白粉病，枯萎病。为现有已知品种，在顾兴芳等人于2008年在《中国蔬菜》第6期第31-33页发表的文章《耐热黄瓜新品种中农106号的选育》中也有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。35份不同遗传背景的黄瓜材料的具体来源和出处详见Zhang等于2010年在《JournaloftheAmericanSocietyforHorticulturalScience》第135期第53-58页发表的文章《GeneticMappingoftheScabResistanceGeneinCucumber》。其中24份为抗性材料，11份为感病材料。本实验室有本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种与黄瓜中抗番木瓜环斑病毒基因prsv连锁的Indel标记，其特征在于：所述标记的引物的核苷酸序列如下：prsvInde2‑F/prsvInde2‑R：CTTCCCCATCATCATACATC/AAGCAGGAGAATGAAACAAC；所述引物扩增的与黄瓜中感番木瓜环斑病毒基因PRSV连锁的特征条带为176bp，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示；所述引物扩增的与黄瓜中抗番木瓜环斑病毒基因prsv连锁的特征条带为170bp，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。
【技术特征摘要】
2014.09.23 CN 201410490586.41.一种与黄瓜中抗番木瓜环斑病毒基因prsv连锁的Indel标记，其特征在于：所述标记的扩增引物的核苷酸序列如下：prsvInde2-F/prsvInde2-R：CTTCCCCATCATCATACATC/AAGCAGGAGAATGAAACAAC；在含有抗番木瓜环斑病毒基因prsv的隐性纯合黄瓜材料中，所述Indel标记的特征条带为170bp，其核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。2.一种与黄瓜中感番木瓜环斑病毒基因PRSV连锁的片段，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。3.一种筛选具有抗番木瓜环斑病毒基因prsv的黄瓜种质资源中的方法，其步骤如下：(1)采用...
【专利技术属性】
技术研发人员：顾兴芳，张圣平，苗晗，田桂丽，王烨，谢丙炎，杨宇红，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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