一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法制造技术

本发明专利技术公开了一种定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法，是将待测样品研磨，制备检测样品上样液，配制阳性、阴性及空白对照上样液，测出阳性对照上样液的病毒粒体平均数d。将2.0~2.5?l检测样品上样液、阳性、阴性及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上，将膜干燥后封闭0.8~1.2h，依次加入稀释后的一抗、二抗，分别反应0.8~1.2h，每次反应后洗膜3~4次，每次5~6min。将膜稍干燥后置于荧光分光光度计中检测荧光强度m，按照下述公式计算检测样品上样液中待检测病毒的粒体平均数d。阳性对照上样液m值：阳性对照上样液d值=检测样品上样液m值：检测样品上样液d值。所述方法能够实现植物病毒的灵敏准确、快捷高效的定量分析，推广应用价值较高。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，是将待测样品研磨，制备检测样品上样液，配制阳性、阴性及空白对照上样液，测出阳性对照上样液的病毒粒体平均数d。将2.0~2.5μl检测样品上样液、阳性、阴性及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上，将膜干燥后封闭0.8~1.2h，依次加入稀释后的一抗、二抗，分别反应0.8~1.2h，每次反应后洗膜3~4次，每次5~6min。将膜稍干燥后置于荧光分光光度计中检测荧光强度m，按照下述公式计算检测样品上样液中待检测病毒的粒体平均数d。阳性对照上样液m值：阳性对照上样液d值=检测样品上样液m值：检测样品上样液d值。所述方法能够实现植物病毒的灵敏准确、快捷高效的定量分析，推广应用价值较高。【专利说明】
本专利技术属于植物病毒定量检测
，具体涉及。
技术介绍
斑点免疫结合法(DIBA)是一种以硝基纤维素薄膜为固相载体进行抗原——抗体免疫学反应的检测和鉴定植物病毒的基础性方法。该方法具有灵敏度高，准确性好，操作简便快捷等优点，但也存在着一些弊端:首先，判断阴、阳性反应只能靠目测，所以在色差较小的样品中，就可能造成错判或漏判；其次，阳性反应的颜色差异虽然从一定程度上反映了阳性样品中病毒的多少，但仍无法实现真正的定量检测。荧光标记技术是利用能发荧光的物质通过共价结合或物理吸附在所要研究的分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息的一种手段。若将斑点免疫结合法与荧光标记技术联合应用，利用荧光显色技术减少斑点免疫结合法的定性误差，提高其定量准确性，对于实现植物病毒灵敏准确、快捷高效的定量分析将具有十分重要的现实意义和推广应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。本专利技术的目的是这样实现的，，包括检测样品及试剂配制、检测及A、检测样品及试剂配制:按重量体积比1:2.5^3.5g/ml，将0.8^1.2g待检测植物样品加入磨样缓冲液中，将植物样品磨碎备用，作为检测样品上样液；按体积比1:1000，将提纯的待检测植物病毒用磨样缓冲液稀释备用，作为阳性对照上样液，并于电镜下测算出阳性对照上样液的病毒粒体平均数d ;按重量体积比1:2.5^3.5g/ml，将0.8^1.2g无待检测病毒的植物样品加入磨样缓冲液中，将植物样品磨碎备用，作为阴性对照上样液；空白对照上样液即为磨样缓冲液； B、检测:将检测样品上样液2.0-2.5μ1点在硝酸纤维素膜上，再将同样体积的阳性对照上样液、阴性对照上样液及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜干燥后，置于容器内，加入封闭液浸没0.Cl.2h，弃去封闭液，加入用稀释缓冲液稀释的一抗，反应0.8^1.2h，弃去一抗，用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3~4次，每次5飞min，再加入用稀释缓冲液稀释的二抗，反应0.8^1.2h，弃去二抗，用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3~4次，每次5~6min ； C、定量分析:将洗涤后的硝酸纤维素膜稍干燥，置于荧光分光光度计中检测荧光强度m，按照下述公式即可算出检测样品上样液中待检测病毒的粒体平均数d:阳性对照上样液m值:阳性对照上样液d值=检测样品上样液m值:检测样品上样液d值 其中，阳性对照上样液d= WN3+……Ny"；y:电镜下观察视野的个数； N:第y个观察视野中的病毒粒体数。本专利技术所述方法将斑点免疫结合法与荧光标记技术联合应用，利用荧光显色技术避免了斑点免疫结合法可能出现的假阳性干扰，通过对固相支持物及底物的选择，进一步减少了定性误差，有效提高了定量准确性，对于实现植物病毒灵敏准确、快捷高效的定量分析具有十分重要的现实意义和较高的推广应用价值。【具体实施方式】下面对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的定量检测植物病毒的荧光免疫斑点法，包括检测样品及试剂配制、检测及定量分析工序，具体包括: A、检测样品及试剂配制:按重量体积比1:2.5^3.5g/ml，将0.8^1.2g待检测植物样品加入磨样缓冲液中，将植物样品磨碎备用，作为检测样品上样液；按体积比1:1000，将提纯的待检测植物病毒用磨样缓冲液稀释备用，作为阳性对照上样液，并于电镜下测算出阳性对照上样液的病毒粒体平均数d ;按重量体积比1:2.5^3.5g/ml，将0.8^1.2g无待检测病毒的植物样品加入磨样缓冲液中，将植物样品磨碎备用，作为阴性对照上样液；空白对照上样液即为磨样缓冲液； B、检测:将检测样品上样液2.0-2.5μ1点在硝酸纤维素膜上，再将同样体积的阳性对照上样液、阴性对照上样液及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上，将硝酸纤维素膜干燥后，置于容器内，加入封闭液浸没0.Cl.2h，弃去封闭液，加入用稀释缓冲液稀释的一抗，反应0.8^1.2h，弃去一抗，用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3~4次，每次5飞min，再加入用稀释缓冲液稀释的二抗，`反应0.8^1.2h，弃去二抗，用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜3~4次，每次5~6min ； C、定量分析:将洗涤后的硝酸纤维素膜稍干燥，置于荧光分光光度计中检测荧光强度m，按照下述公式即可算出检测样品上样液中待检测病毒的粒体平均数d: 阳性对照上样液m值:阳性对照上样液d值=检测样品上样液m值:检测样品上样液d值 其中，阳性对照上样液d= WN3+……Ny"； y:电镜下观察视野的个数； N:第y个观察视野中的病毒粒体数。所述的磨样缓冲液为加入0.01%吐温20的pH为7.0的PBST，稀释缓冲液为pH为7.0的PBST，洗涤缓冲液为加入0.01%吐温20的pH为7.0的PBST。步骤A所述的植物样品可以为植物的叶、花、果或茎中的任一种。步骤A所述的将植物样品磨碎备用，指的是将植物样品置于加厚的自封袋中，用研钵棒磨出汁液即可，但保证所有组织都研磨到。步骤A所述的测算出阳性对照上样液的病毒粒体平均数d，指的是在电子显微镜下观察阳性对照上样液的I个视野，数取每个视野的病毒粒体数N，用下述公式计算出y个视野的病毒粒体平均数d。d= WN3+......Ny/y y:电镜下观察视野的个数； N:第y个观察视野中的病毒粒体数。y值取25~35即可，优选取30。步骤B所述的将检测样品上样液、阳性对照上样液、阴性对照上样液及空白对照上样液分别点在硝酸纤维素膜上，指的是用移液器吸取2.0-2.5μ1检测样品上样液点在硝酸纤维素膜上，然后用移液器吸取同样体积的阳性对照上样液点在检测样品上样液的旁边，再依次将同样体积的阴性对照上样液点在阳性对照上样液的旁边，将空白对照上样液点在阴性对照上样液的旁边。步骤B所述的封闭液为用稀释缓冲液配制的质量百分比为4~6%的脱脂奶粉。步骤B所述的将硝酸纤维素膜干燥，指的是将硝酸纤维素膜置于室温下自然干燥，或是将硝酸纤维素膜置于37°C培养箱中干燥。所述的室温为20~25°C。步骤B所述的将硝酸纤维素膜干燥后，置于容器内，加入封闭液浸没，指的是将硝酸纤维素膜置于容器中，加入5^20ml封闭液，淹没硝酸纤维素膜，再将容器置于37°C培养箱中封闭0.8~1.2h。 所述的容器为培养皿。所述的加入5~20ml封闭液，淹没硝酸纤维素膜，指的是直径为6cm的培养皿本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：丁铭，卢训，张仲凯，
申请(专利权)人：云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，
类型：发明
国别省市：