本发明专利技术涉及一种基于液滴微流控的铂黑修饰电极电化学传感器制备方法，及其在葡萄糖氧化酶反应动力学研究和酶抑制分析中的应用，属于分析化学领域。本发明专利技术通过电沉积的方法制备铂黑微电极，并将液滴浓度梯度生成和电化学检测结合在微流控芯片中。连续测定液滴中酶反应产物的浓度，进行酶反应动力学研究和酶抑制分析。本发明专利技术利用了液滴微流控系统试样消耗量低，检测通量高的特点，又结合了修饰电极灵敏度高的优势，与裸电极相比，检测信号提高了10.2倍，对葡萄糖检测的线性范围在0.2~43.5μM，可用于构建新型的葡萄糖传感器。本发明专利技术中的电化学传感器还可用于重金属离子抑制效率的分析，通过绘制抑制效率-浓度曲线，实现重金属离子的检测。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种基于液滴微流控的铂黑修饰电极电化学传感器制备方法，及其在葡萄糖氧化酶反应动力学研究和酶抑制分析中的应用，属于分析化学领域。本专利技术通过电沉积的方法制备铂黑微电极，并将液滴浓度梯度生成和电化学检测结合在微流控芯片中。连续测定液滴中酶反应产物的浓度，进行酶反应动力学研究和酶抑制分析。本专利技术利用了液滴微流控系统试样消耗量低，检测通量高的特点，又结合了修饰电极灵敏度高的优势，与裸电极相比，检测信号提高了10.2倍，对葡萄糖检测的线性范围在0.2~43.5μM，可用于构建新型的葡萄糖传感器。本专利技术中的电化学传感器还可用于重金属离子抑制效率的分析，通过绘制抑制效率-浓度曲线，实现重金属离子的检测。【专利说明】基于液滴微流控的铂黑修饰电极生物传感器的制备方法及其应用
本专利技术涉及一种基于液滴微流控的钼黑修饰电极生物传感器制备方法，及其在葡萄糖氧化酶活性检测和酶抑制分析中的应用，属于分析化学领域。
技术介绍
液滴微流控是近年来在微流控芯片中发展起来的一种操纵微小体积液体的技术。液滴作为微反应器，将反应物和产物限制在一个狭小的空间内，能够有效控制扩散；在流动的液滴内部存在着复杂的三维运动，能够加速混合，提高反应速度；产物在液滴内部不断的累积，在液滴辖制的小体积内可以达到很高的浓度，能够提高检测的灵敏度。因此，液滴系统正被广泛应用于各种生化反应的研究中，包括反应动力学研究、高通量筛选、单细胞分析、材料合成等。液滴分析技术对于液滴微流控的发展起到至关重要的作用。目前液滴微流控系统中常用的检测方法主要有荧光，毛细管电泳，质谱和拉曼光谱等。这些分析技术操作相对较为复杂，并且需要较大体积或昂贵的仪器设备。电化学检测具有灵敏度高，外部设备小等优点，非常符合微流控系统微型化集成化的要求。电化学检测方法将电极作为传感器，直接将液滴中的化学信号转换为电信号。但是，由于两相的复杂性，电化学检测技术在液滴微流控系统中的应用还比较少。迄今为止，液滴微流控系统中，电化学检测主要被用来监测反应动力学和研究液滴的流动行为。这些系统都一般都选用常规无修饰电极，由于液滴微小体积的限制，电极与待测物接触面积较小，相应的检测灵敏度受到限制。最近有科研工作者将高灵敏的修饰电极用于单细胞活性分析，用于有酶葡萄糖检测，以及无酶葡萄糖检测。但是，这些系统采用的都是较大体积的静止液滴。因此，需要发展一种适合于小体积液滴连续在线分析的电化学传感系统。纳米材料由于具有较好的生物兼容性和电化学催化活性，被广泛的应用于微电极的修饰和传感器的构建中。通过对电极表面进行物理或化学修饰可以有效提高其检测性能和应用领域。在众多的纳米材料中，金属纳米颗粒是在生物传感器的构建中应用最为广泛的一种纳米材料。钼黑，是通过电沉积方法形成的纳米钼金属层，具有良好的电催化能力和优越的生物兼容性，可以用于提高生物传感器的灵敏度。
技术实现思路
针对现有液滴分析技术存在的不足，本专利技术提供一种高灵敏的基于钼黑修饰电极的液滴电化学分析方法，目的是通过在微钼电极上电镀一层钼黑，提高液滴微流控系统中电化学检测的灵敏度，并基于此在液滴微流控系统中建立一种可用于酶反应动力学研究和酶抑制分析的生物电化学传感器。液滴微流控系统中钼黑修饰电极的生物传感器的制备及其在酶活性检测中的应用，实现本专利技术的技术方案是:1.基于液滴微流控系统钼黑修饰电极的生物传感器的制备 a.裸钼电极的配置及预处理:取长2cm,直径100 μπι的钼丝,缠绕在长5 cm,直径100 μπι的铜丝上，并用导电胶固定，作为裸钼电极；将该电极放入0.1 M的硫酸中以Ag/AgCl电极作为参比电极,钼电极为对电极,在-0.2~1.45 V范围内扫循环伏安进行活化，扫速为500 mv/s,扫描40圈，用去离子水洗净； b.钼黑修饰微电极的制备:利用恒电位技术将钼黑电沉积在上述处理好的裸钼电极上，电沉积溶液为0.1 M KCl, 2 mM H2PtClf^Pl mMPb (Ac)2溶液，Pb (Ac)2作为晶体生长促进剂，沉积电位为-0.1 V,沉积时间为10 min ;将修饰后的电极在-0.2~1.45 V范围内扫循环伏安进行活化，扫速为500 mv/s，扫描40圈，用去离子水洗净，并储存在去离子水中备用。c.钼黑修饰电极生物传感器的制备:将由上述方法制备所得的钼黑修饰电极与微流控芯片结合组装。微流控芯片是一种结合了液滴浓度梯度生成和电化学检测的芯片装置，其是由具有上下两层结构的微流控芯片组成，所用材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。微流控芯片下层是平板基片，厚度约3 mm;上层是含有通道的盖片，包括150Mm深，300Mffl宽的液流通道和IOOMm深，IOOMm宽的电极通道厚度约4 mm ;上下两层基片相对封接，形成底层封闭的微通道网络；最后将钼黑修饰电极以及Ag/AgCl准参比电极插入电极微通道中，并用环氧胶固定。 2、本专利技术所述的生物传感器的用途和应用方法包括有: a.在葡萄糖氧化酶活性检测上的应用:钼黑修饰的微米级钼丝电极作做为工作电极，Ag/AgCl电极作为准参比电极，在通道中引入葡萄糖氧化酶、葡萄糖和缓冲液，葡萄糖溶液的进样时间为30 S，进样量为750 nL,形成81个具有浓度梯度的液滴，液滴中葡萄糖的浓度范围为0.2~57 μΜ ;液滴顺序流过电极，记录下电流-时间曲线，改变酶的浓度，得到不同浓度下葡萄糖氧化酶的反应动力学曲线；在葡萄糖浓度为0.2~43.5 μ M范围内，得到电流与葡萄糖浓度的线性关系曲线，其线性相关系数R= 0.996，利用标准曲线法可以对葡萄糖进行分析检测。b..重金属对酶抑制分析中的应用:在通道中引入浓度范围在0.2~57 uM的重金属离子Cu2+，Pb2+，Co2+与1.0 mg/L的葡萄糖氧化酶和I mM葡萄糖溶液反应，采用计时电流法检测经重金属离子抑制后酶反应产生的双氧水的电化学信号。比较相同浓度下三种重金属离子的抑制效率，利用标准曲线法可以对重金属离子进行分析检测。与现有技术相比，本专利技术的优点和有益效果是: 本专利技术利用了电沉积方法制备的钼黑修饰微电极作为液滴微流控系统中液滴检测的传感器，无需固定化酶，在溶液状态下实现了对葡萄糖氧化酶反应动力学的监测以及酶活性的抑制分析，检测通量高，试样消耗量低，而且与裸钼微电极相比，钼黑修饰电极大大提高了分析检测的灵敏度。本专利技术中的生物传感器是一种新型的基于液滴微流控系统的电化学传感器，具有高通量、低消耗、灵敏度高、制备简单等特点。本专利技术的测试方法具有良好的重现性和稳定性。本专利技术中的新型生物电化学传感器表明了在液滴微流控系统中构建高灵敏电化学传感器的可行性并且有利于拓展液滴微流控系统的应用范围。【专利附图】【附图说明】图1 A为本专利技术中含有lmg/L葡萄糖氧化酶，不含葡萄糖的NaAc-HAc缓冲溶液在裸钼微电极(I)以及在钼黑修饰微电极(3)上的循环伏安图；以及含有lmg/L葡萄糖氧化酶和10μm葡萄糖的NaAc-HAc缓冲液在裸钼微电极(2)以及在钼黑修饰微电极(4)上的循环伏安图。图1 B为含有1.0 mg/L葡萄糖氧化酶和5 mM葡萄糖的液滴在裸钼微电极和钼黑修饰微电极上的电流响应信号。图2为本专利技术中的生物电化学传感本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于液滴微流控的铂黑修饰电极生物传感器的制备方法，其特征在于具有以下的步骤 ：a. 裸铂电极的配置及预处理：取长2 cm, 直径100 μm的铂丝，缠绕在长5 cm, 直径100 μm的铜丝上，并用导电胶固定，作为裸铂电极；将该电极放入 0.1 M 的硫酸中以Ag/AgCl 电极作为参比电极，铂电极为对电极，在‑0.2～1.45V范围内扫循环伏安进行活化，扫速为 500 mv/s，扫描 40 圈, 用去离子水洗净；b.铂黑修饰微电极的制备：利用恒电位技术将铂黑电沉积在上述处理好的裸铂电极上，电沉积溶液为0.1 M KCl, 2 mM H2PtCl6 和1 mM Pb(Ac)2 溶液，Pb(Ac)2作为晶体生长促进剂，沉积电位为‑0.1 V, 沉积时间为10 min；将修饰后的电极在‑0.2～1.45V范围内扫循环伏安进行活化，扫速为 500 mv/s，扫描 40 圈, 用去离子水洗净，并储存在去离子水中备用；c.铂黑修饰电极生物传感器的制备：将由上述方法制备所得的铂黑修饰电极与微流控芯片结合组装。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁亚平，古淑青，陆优兰，李丽，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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