本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器，还涉及该传感器的制备方法和应用，该适配子型生物传感器包括压电基底、反射栅阵列和叉指换能器，所述压电基底上依次附着有铬膜和金膜，所述金膜表面包被有适配子，所述适配子为碱基序列如ＳＥＱＩ?ＤＮＯ：1所示的寡核苷酸单链。本发明专利技术建立了一种高灵敏性、高特异性和高亲和力的适配子型生物传感器用于循环肿瘤细胞的快速检测，可辅助用于肿瘤转移的早期诊断。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器，还涉及该传感器的制备方法和应用，该适配子型生物传感器包括压电基底、反射栅阵列和叉指换能器，所述压电基底上依次附着有铬膜和金膜，所述金膜表面包被有适配子，所述适配子为碱基序列如ＳＥＱＩ?ＤＮＯ：1所示的寡核苷酸单链。本专利技术建立了一种高灵敏性、高特异性和高亲和力的适配子型生物传感器用于循环肿瘤细胞的快速检测，可辅助用于肿瘤转移的早期诊断。【专利说明】用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器，还涉及该传感器的制备方法和应用。
技术介绍
肿瘤是直接威胁人类生命健康的重要致死性疾病，近年来其发病率逐渐上升，预计到2030年因肿瘤死亡的人数将达到1500万。研究证实，恶性肿瘤患者死亡的最主要原因是肿瘤转移的发生，其占肿瘤相关死亡的90%。肿瘤转移是一个涉及多步骤多因素的复杂过程，肿瘤细胞在原发灶侵袭、脱落进入循环系统是肿瘤转移的最初阶段，大部分肿瘤细胞由于机体的免疫系统的识别，杀伤及自身凋亡在短期内死亡，只有极少数存活下来转移到血液、骨髓、淋巴结或远处器官，发展为转移灶。肿瘤转移在疾病的分期、治疗及进展中发挥着决定性的作用，因此，肿瘤转移的早期发现对肿瘤复发和预后的判断至关重要，并对指导临床治疗有重大意义。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是自发或因诊疗操作过程中由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。研究证实=CTCs存在于乳腺癌、肺癌、膀胱癌、结直肠癌、前列腺癌及卵巢癌中，并且与患者的临床分期、患者生存期、肿瘤复发、转移及治疗效果密切相关。与传统的免疫组织化学方法、影像学表现及肿瘤血清学标志物相t匕，由于外周血液获取容易且相对无创，CTCs被认为是实时的“液体活检”，其为肿瘤早期诊断和疗效的实时监测提供了新的方向。但是，外周血循环中CTCs数目极少，肿瘤患者血液中每IO6-1O7个白细胞中含有I个CTC，并且CTCs释放入血呈现不连续性和异质性，这使得CTCs快速、灵敏的检测一直受到挑战。因此，迫切需要发展一种灵敏度高、特异性好、无需标记、实时监测、操作简单的CTCs检测方法。目前，CTCs的检测包括富集和检测两个步骤，其中为了实现CTCs的检测主要包括以下两种策略:①免疫表型的分析方法(CellSearch，EPISPOT，CTC-chip等)，②通过PCR扩增恶性细胞突变的方法。但是这些方法由于需特殊检测仪器和操作复杂而受限，同时技术上需要荧光或生物学标记，且结果存在重复性差，假阳性，难以标准化判定等问题。生物传感器(biosensor)是对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器，由固定化的生物敏感材料作识别元件(包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质)与适当的理化换能器(如氧电极、光敏管、场效应管、压电晶体等等)及信号放大装置构成的分析工具或系统。生物传感器由于集高效、灵敏、特异、结构小巧、经济实用等优点于一身，目前已成为生命科学领域的研究热点。近年来，随着声光、微电子技术的发展，一种新型传感器-漏声表面波(Leaky Surface Acoustic Wave, LSAW)传感器逐渐发展起来。它利用了压电晶体的特殊切向(如:Y方向切割36°旋转、X方向传播的LiTaO3晶体)激励出LSAW，当LSAW传播路径表面的质量负载发生微小改变时(靶序列与固定的探针发生反应)，传感器表面的边界条件将发生改变，导致LSAW传播的频率和相位发生相应的改变，此时从传感器输出换能器提取的电信号的频率和相位即可随之发生变化，从而可极为敏感地探测出与传感器晶体表面固定的探针发生特异性反应的待测靶物质。总体上讲，LSAff传感器具有如下几个优点:1)高灵敏度，高精度；2)重复性及可靠性更好；3)功耗低；4)结构工艺性好。这使LSAW传感器具有了非常广泛的应用前景。适配子(aptamer)是通过指数富集配基系统进化技术(SELEX)筛选得到的DNA或RNA核酸序列。SELEX是一种从大容量寡核苷酸文库中经反复分离扩增步骤得到针对靶分子的高亲和力高特异性核酸配基一适配子的体外筛选技术，主要包括结合、分离、洗脱、扩增和调节五个步骤。首先将包含有IO13-1O15个随机序列的核苷酸序列库(ssDNA文库、RNA文库)与靶分子混合温育，随后通过物理方法分离出结合了靶分子的核苷酸序列。洗脱收集获得结合序列，并将结合序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增生成次级文库，用于下轮筛选。一帮通过6-20轮SELEX循环，对已达到高亲和力的扩增产物进行克隆测序，从而获得特异性识别靶分子的适配子。在生物传感器的构建方面，适配子可以高特异性和亲和力的识别靶分子，其与靶分子结合的解离常数可达到10_9_10_12 ;同时适配子还具有稳定性和重复性好、可反复使用和长期保存、筛选周期很短、对温度不敏感、变性之后还可以复性而恢复原来的三维结构等优势，是一种高效、快速的检测手段。另外，适配子还具有一些优于抗体的优点:1)适配体是通过体外筛选获得，如SELEX筛选周期一般为2-3个月，最快的只需2周，而制备单克隆抗体则至少需要3-6个月，且成本昂贵；2)适配子是通过化学法合成的，因而可以在适配子上灵活修饰多种基因，使其具有多种功能；3)抗体的蛋白质决定了它容易变性，传统免疫生 物传感器化学和物理性质的不稳定限制了生物传感器的应用范围，而适配子具有化学稳定性，在PH2-12的宽范围内保持稳定，并具有一定的热复性；4)适配子组成简单，一般由几十个核苷酸(少于IOOnt)组成，因而适配子的设计相对简单。由于适配子拥有抗体无法比拟的优势，利用适配子设计生物传感器对循环肿瘤细胞进行识别和检测，具有极其重要的意义。基于以上理论，本专利技术结合生物传感器的高灵敏性和适配子的高特异性和高亲和力，建立一种用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器，以满足对肿瘤转移早期判定的需求。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术首先提供一种可高特异性和高亲和力的识别循环肿瘤细胞的适配子，即碱基序列如S E QIDNO:1所示的单链寡核苷酸。该单链寡核苷酸通过指数富集配基系统进化技术(SELEX)筛选得到。其筛选过程采用完整的MCF-7细胞作为复合靶分子，并采用Romas细胞和K562细胞进行反向、消减筛选，故对循环肿瘤细胞具有高特异性和高亲和力，特别适合作为适配子用于循环肿瘤细胞检测的生物传感器。本专利技术的目的就在于上述的单链寡核苷酸在用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器中的应用。具体地，本专利技术提供一种高灵敏性、高特异性和高亲和力的用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为:用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器，包括压电基底、反射栅阵列和叉指换能器，所述压电基底上依次附着有铬膜和金膜，所述金膜表面包被有适配子，所述适配子为碱基序列如S EQIDNO:!所示的单链寡核苷酸。本专利技术的单链寡核苷酸作为适配子用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器，并不限于上述生物本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于循环肿瘤细胞快速检测的适配子型生物传感器，包括压电基底（1）、反射栅阵列和叉指换能器，其特征在于：所述压电基底（1）上依次附着有铬膜（2）和金膜（3），所述金膜（3）表面包被有适配子（4），所述适配子（4）为碱基序列如ＳＥＱＩＤＮＯ：1所示的单链寡核苷酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：唱凯，陈鸣，皮燕，邓少丽，鲁卫平，王丰，贾双荣，李发科，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：
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