一种制备多糖的新方法技术

一种新的无酒精和CTAB的纯化荚膜多糖的方法，其中纯化的多糖中C-多糖、蛋白质、核酸含量大大减少。所述方法是有成本效益的，且是节约劳动力的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
被分类为肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae, pneumococci, Pn)的病原菌，依据有机体的荚膜多糖(PnPs)被细分成84种抗原血清型。由这些有机体引起的疾病状态包括肺炎、脑膜炎、中耳炎、慢性支气管炎的菌血症和急性加重期、鼻窦炎、关节炎和结膜炎。然而，这些疾病中的多数是由已知的84种分离株中有限的亚系引起的。因此，含有这些有机体的最普遍和最致病的分离株的PnPs的多价疫苗，能提供针对这个分类中最常报道的病原菌中的很高比例的保护。用于制备结合疫苗的PnPs通常与大量的常见杂质/污染物相结合，这些杂质/污染物称为C-多糖(C-Ps)。虽然C-多糖污染物的存在不会干扰针对类型特异性抗原的免疫应答，但是抗-c-多糖抗体的产生可能与组织破坏有关，这种组织破坏在一些未分辨的肺炎球菌感染中被观察到。C-Ps内容物能降低肺炎球菌结合疫苗的效力。C-Ps也被WHO分类为一种多糖杂质，参考WHO TRS19-2310月，2009 (保证肺炎球菌结合疫苗的质量、安全性和效力的建议，Recommendations to assure the quality, safetyand efficacy of pneumococcal conjugate vaccines)。因此，提高多糖纯度，即降低基团-特异性C-多糖的污染的需求一直存在于工业中。美国专利4242501请求保护基于硫酸铵的多糖沉淀方法，其中C-多糖含量降低到少于0.5%。然而这种纯化方法包含12步，并且也利用酒精进行沉淀。美国专利5623057请求保护基于使用异丙醇的PnPs纯化方法，并且在多糖部分水解(声波的或热的)之前或之后也`使用离子交换色谱，使C-多糖含量少于3%。美国专利5714354请求保护一种“无酒精”的PnPs纯化方法，使用CTAB (1-4%)、羟磷灰石色谱和离子交换色谱。此方法中CTAB步骤除去了大多数C-多糖。美国专利5847112请求保护C_Ps降低3_20倍。然而此专利的PnPs纯化包含多个异丙醇和塞他弗伦步骤。1572/MUM/2010请求保护一种基于脱氧胆酸盐和疏水作用色谱(即无酒精和CTAB)的纯化方法。此专利中C-Ps的含量是4-14%。现有技术的方法使用CTAB、酒精并且是多步骤的。CTAB以前已被用来进行多糖的选择性沉淀，然而，CTAB是有害化学品。从沉淀的PnPs中进一步除去CTAB需要乙醇。在肺炎球菌多糖纯化中，乙醇的使用与下列操作问题有关:a)乙醇的使用需要防火设施；b)设计这样的设施成本很高，c)乙醇受海关/政府的监管，d)乙醇是有害的，e)废水处理非常困难，f)需要的乙醇量巨大，每升加工材料几乎需要~4-6L乙醇，并且g)需要昂贵的炭过滤和冻干步骤。现有技术利用乙醇和CTAB步骤的方法需要77_90hrs以完成C_Ps_降低的多糖制备，因此是耗劳动力的。出人意料地，我们发现在制备肺炎球菌多糖时，当使用优选地单个或多个色谱步骤时，能观察到基团特异性C-Ps含量的大量减少。所述的步骤是无酒精和CTAB的，容易规模化、是有成本效率的以及劳动力节约的。
技术实现思路
本专利技术是一种无酒精和CTAB的纯化肺炎球菌多糖的方法，用于多糖疫苗的制备。本方法基于C-Ps和PnPs表面净电荷的差异，用色谱分离的方法从多糖(PnPs)中分离C-Ps0此方法是纯化肺炎球菌多糖的通用方法。通过本方法制备的PnPs有约60至70%的回收率，其中C-多糖污染物相比于疏水作用色谱(HIC)之后或离子交换色谱(IEX)之前的C-Ps的含量降低I至5倍，蛋白质污染物少于1%，且核酸污染物少于1%。所述的方法已经在研究、中试和生产规模实现。此方法与基于CTAB/酒精的方法相比，纯化多糖能节约80-90%的时间以及降低90%的成本。【附图说明】HIC后随离子交换色谱的图图1HIC前的肺炎球菌多糖19F-HPLC图谱图2疏水作用色谱(HIC)后的肺炎球菌多糖19F-HPLC图谱图319F PnPs-HIC 色谱-后的 NMR图4HIC-纯化的PnPs的离子交换色谱图图5IEX之后的19F PnPs (最终PnPs/实施例1)的HPLC图谱图6IEX 之后的 PnPs 的 NMR直接离子交换色谱的图图7IEX前的肺炎球菌多糖的19F-HPLC图谱图8 =HIC前(部分纯化PnPs)的离子交换色谱图图9:1EX 后的 19F PnPs 的 HPLC 图谱图10:1EX 后的 19F PnPs 的 NMR离子交换色谱后随HIC的图图11:1EX 后的 19F PnPs 的 HPLC 图谱图12:HIC 后的 19F PnPs 的 HPLC 图谱图 13:1EX-HIC 后的 19F PnPs 的 NMR【具体实施方式】定义:术语“杂质”(impurity)和“污染物”(contaminant)以及它们的语法变异，可互换地用于表示C-多糖。术语“目标多糖”用于指代肺炎球菌荚膜多糖，同上所述。术语“色谱”指代一种方法，通过这种方法，在混合物中的目标溶质，如一种目标多糖，与混合物中的其它溶质分离，这种分离是由混合物渗流过吸附剂实现的，根据溶质的性质，吸附剂对溶质有更强或较弱的吸附或保留。术语“疏水作用色谱”指代一种分离目标物的方法，这种方法基于目标物对疏水分离基质的相对疏水作用的强度。在本文中，“疏水性”被定义为一种非极性化合物和极性环境间的斥力。术语“离子交换”和“离子交换色谱”指代一种色谱方法，在这种色谱方法中，离子化的目标溶质和连接在固相离子交换材料上的带相反电荷的配体在合适的pH和传导性条件下相互作用，由此混合物中目标溶质对带电化合物的非特异性相互作用比杂质或污染物溶质更强或更弱。混合物中的污染物溶质能从离子交换材料的柱上洗下，或结合到树脂或从树脂排除，速度比目标溶质更快或更慢。“离子交换色谱”特定地包括阳离子交换、阴离子交换和混合模式色谱。本专利技术的肺炎球菌多糖纯化方法包括以下步骤:(a)在含有肺炎链球菌细菌的发酵培养基中用裂解剂裂解细菌细胞，从而得到包含多糖溶液和固体细胞碎片的裂解物；(b)将固体与多糖溶液分离，使含水细胞裂解物澄清；(c)用截留分子量为100K的膜进行超滤以浓缩多糖溶液，除去低分子量污染物以形成浓缩的多糖的溶液；(d)用核酸酶对含有多糖的溶液进行处理；(e)用硫酸铵或DOC-NaCl处理沉淀杂质；(f)用截留分子量为100K的膜进行透析；(g)将多糖溶液进行单步或多步色谱；(h)浓缩及透析；以及(i)对多糖溶液的无菌过滤。根据本专利技术，离子交换依据Ps和C-Ps表面净电荷的差异对Ps和C-Ps进行分离。分子在它们的荷电性能上变化很大，并会根据它们总电荷、电荷密度和表面电荷分布的差异对带电色谱介质展现不同程度的相互作用。根据本专利技术，所述单步或多步色谱能包括i)疏水作用色谱，后随离子交换或ii)直接离子交换或iii)离子交换后随HIC。优选地，疏水吸附剂能选自丁基_、苯基-和辛基-琼脂糖和丁基_、苯基-和醚-有机高分子树脂，但也不局限于此。在上柱和上柱后的高盐(2M至5M或50%饱和度的铵盐)洗涤中，荚膜多糖会作为流穿液流出，而更疏水的蛋白质和核酸将被保留在柱上。进一步地，所述第二色谱柱是离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有成本效益、基于无酒精和CTAB的色谱的方法，用于从抗原性多糖中去除C‑多糖，包括以下步骤：(a)用脱氧胆酸盐裂解发酵培养基中的细菌细胞，产生包含多糖溶液和固体细胞碎片的裂解物；(b)通过将固体与所述多糖溶液分离，使含水细胞裂解物澄清；(c)用截留分子量为100K的膜进行超滤，浓缩所述多糖溶液，除去低分子量污染物以形成浓缩的多糖的溶液；(d)用核酸酶对所述含有多糖的溶液进行处理；(e)用硫酸铵或脱氧胆酸钠处理，沉淀杂质；(f)用截留分子量为100K的膜进行透析；(g)将多糖溶液进行单步或多步色谱；(h)浓缩及透析；以及(i)对纯化的多糖溶液进行无菌过滤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.03.22 IN 838/MUM/20111.一种具有成本效益、基于无酒精和CTAB的色谱的方法，用于从抗原性多糖中去除C-多糖，包括以下步骤:(a)用脱氧胆酸盐裂解发酵培养基中的细菌细胞，产生包含多糖溶液和固体细胞碎片的裂解物；(b)通过将固体与所述多糖溶液分离，使含水细胞裂解物澄清；(c)用截留分子量为100K的膜进行超滤，浓缩所述多糖溶液，除去低分子量污染物以形成浓缩的多糖的溶液；(d)用核酸酶对所述含有多糖的溶液进行处理；(e)用硫酸铵或脱氧胆酸钠处理，沉淀杂质；(f)用截留分子量为100K的膜进行透析；(g)将多糖溶液进行单步或多步色谱；(h)浓缩及透析；以及(i)对纯化的多糖溶液进行无菌过滤。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述纯化的荚膜多糖中的类型特异性C-多糖污染物相对于所述离子交换色谱前或疏水作用色谱(HIC)后的C-多糖下降1-5倍，蛋白质污染物少于1%，且核酸污染物少于1%。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法比基于CTAB/酒精的方法需要至少少于80%的时间，及至少少于90%的成本。4.根据权利要求1所述的方法，其中，多糖抗原选自但不限于肺炎链球菌(S.pneumoniae)和无乳链球菌(S.agalactiae)。5.根据权利要求4所述的方法,其中,所述肺炎链球菌(S.pneumoniae)多糖抗原选自血清型 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、F、18C、19A、19F、20、22F、23F和 33F。6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述单步或多步色谱能包含i)疏水作用后随离子交换、ii)直接离子交换和iii)离子交换后随HIC。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述疏水作用色谱支持物选自如下的组，包含丁基-、苯基-、辛基-琼脂糖、丁基-、醚-有机高分子树脂和苯基琼脂糖凝胶。8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述疏水作用色谱柱在pH5至8范围内运行，优选地为6至7.6。9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述疏水作用色谱使用磷酸钠或磷酸钾缓冲液，所述磷酸钠或磷酸钾缓冲液含有50%饱和度的硫酸铵盐、浓度范围从2M到5M的氯化钠及仅浓度范围从2M到3M的硫酸钠。10.根据权利要求6所述的方法，其中，所述离子交换色谱是一种阴离子交换色谱。1...

【专利技术属性】
技术研发人员：萨博哈士·维纳亚克·卡普瑞，斯瓦潘·库马尔·珍纳，图沙尔·丁亚奈士瓦·乔格莱卡，
申请(专利权)人：印度血清研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN