一种锦紫苏类病毒快速检测方法技术

一种锦紫苏类病毒病毒的快速检测方法，其特征在于：包括锦紫苏类病毒RNA的提取、RT-PCR反应和PCR产物的核酸胶体金层析试纸条检测等步骤。本发明专利技术是在优化锦紫苏类病毒RNA的提取方法的前提下，将RT-PCR技术与核酸胶体金免疫层析技术相结合，建立的适用于锦紫苏类病毒的快速检测方法。其最大的特点是首先简化了RNA的提取过程，直接用超纯水稀释后可进行RT-PCR检测。其次，与核酸胶体金层析试纸条在10分钟内即可完成PCR产物的检测，不需要电泳和溴化乙锭的染色，更为快速实用，且安全无污染。在实际生产中快速检查带病毒植物体，一旦发现被感染的材料就应该立即淘汰或连根拔除，挽回了巨大的经济损失。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】一种锦紫苏类病毒病毒的快速检测方法，其特征在于：包括锦紫苏类病毒RNA的提取、RT-PCR反应和PCR产物的核酸胶体金层析试纸条检测等步骤。本专利技术是在优化锦紫苏类病毒RNA的提取方法的前提下，将RT-PCR技术与核酸胶体金免疫层析技术相结合，建立的适用于锦紫苏类病毒的快速检测方法。其最大的特点是首先简化了RNA的提取过程，直接用超纯水稀释后可进行RT-PCR检测。其次，与核酸胶体金层析试纸条在10分钟内即可完成PCR产物的检测，不需要电泳和溴化乙锭的染色，更为快速实用，且安全无污染。在实际生产中快速检查带病毒植物体，一旦发现被感染的材料就应该立即淘汰或连根拔除，挽回了巨大的经济损失。【专利说明】
本专利技术涉及，主要是利用RT-PCR联合核酸免疫胶体金层析试纸条法快速检测锦紫苏类病毒的方法。
技术介绍
锦紫苏类病毒(Coleus blumei viroid)属于马铃薯纺锤类病毒(Pospiviroidae)科锦紫苏类病毒属，具有属内特有的中央保守区。该属类病毒主要侵染锦紫苏(一种在世界广泛种植的观叶性园艺植物)。目前已有锦紫苏类病毒1，3，5等多种该属类病毒在中国发生(苏前富，2006，植物保护；Hou et al，2009)。受到锦紫苏类病毒侵染的植株会出现植株矮化、叶片黄化或斑驳等症状(Fonseca et al, 1989),极大地影响了锦紫苏的观赏和使用。1991年加拿大的Singh等人研究发现锦紫苏类病毒在锦紫苏上的带毒率非常高且能够通过种子进行传播(Singh et al，1991)。由于感染类病毒的植株极易通过扦插、机械损伤等途径进行广泛的传播，且控制类病毒疾病最有效的方法是使用未被感染的植物材料，一旦发现被感染的材料就应该立即淘汰或连根拔除，造成了一定的经济损失。类病毒是单链环状RNA分子，没有外壳蛋白，用于检测病毒的血清学方法例如酶联免疫吸附反应(ELISA)等不能用于类病毒的检测。类病毒的检测主要是生物学检测，聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法，核酸杂交法，反转录-聚合酶链式发应(RT-PCR)。生物学检测(Biological indexing)建立在敏感的指示植物的症状之上,根据报道目前能侵染指不植物的类病毒局限于Posoiviroid, Hostuviroid和CChMVd,有些类病毒不存在草本指示植物，而且对于某些类病毒的木本指示植物通常需要1-2年的时间才能判断是否发病。指示植物接种的标准方法是通过机械摩擦和嫁接进行。“刀割法”比汁液摩擦接种作用更明显，即在指示植物的茎或叶柄上用带有接种源的刀片切割。此外，用酚氯仿(I: I)抽提，乙醇沉淀制备的粗核酸做为接种源成功率更高。所以生物学鉴定方法比较费时而且对温室的温度等各方面的要求都比较高(Huttinga，1996)。有时不同种类的类病毒在相同的指示植物上可以弓I起相似甚至相同的症状，致使仅靠表观症状很难做出准确的判断。生物学检测的缺点是费时，需要建立占地面积较大的可控的温室，需要保持28-30度高温条件，另外还有许多指示植物例如番茄和柑橘感染不同的类病毒的症状表现难以区另O，很难特异性地鉴别区分一种特定的类病毒。虽然生物学检测有上述缺点，但是生物学鉴定能够提供类病毒自我复制和致病性的依据。聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种基于类病毒RNA分子的特殊环状结构进行检测的方法。它能检测出一种病原物是否为类病毒，但是该方法步骤繁多，耗时耗力。核酸杂交灵敏度比聚丙烯酰胺凝胶电泳高，而且所需样品量很少。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下可按碱基互补原则退火形成双链，这个过程具有高度特异性。核酸杂交需要制备特异性探针。但是该方法步骤繁多，耗时耗力。利用RT-PCR检测类病毒是一种非常灵敏的方法。通常RT-PCR灵敏度比cRNA探针的斑点杂交灵敏度高10-100倍(Nakahara et al，1999)。RT-PCR对模板的纯度要求高，如果检测样品中存在扩增抑制物的话，将很难扩增出目的条带，尤其是果树类的材料，含有大量的多酚类和糖类等。糖类一般可以用乙二醇单甲醚来去除。PVP能有效束缚酚类化合物，在PCR混合物中加入PVP能有效地除去从组织中制备的RNA中的阻遏物(Koonjul etal, 1999)。但是PCR产物的检测常规方法是采用琼脂糖凝胶电泳进行，电泳后需要进行溴化乙锭染色后在紫外光下观察，溴化乙锭对人具有中等毒性和致癌性，易造成环境污染，这也严重限制了此方法的推广。
技术实现思路
本专利技术的目的正是针对上述现有技术所存在的问题而专门研制的一种锦紫苏类病毒的快速检测方法，该方法是在简化锦紫苏类病毒RNA提取方法的前提下，通过设计的可检测多种锦紫苏类病毒的通用引物，并将PT-PCR技术与核酸胶体金免疫层析技术相结合，建立的适用于锦紫苏类病毒的快速检测方法。本专利技术的目的通过以下技术方案来实现的:一种锦紫苏类病毒的快速检测方法，包括锦紫苏类病毒RNA的提取、RT-PCR反应和PCR产物的核酸胶体金层析试纸条检测三大步骤，具体如下:(I)用移液枪从新鲜的锦紫苏植物茎干或者叶片中吸取汁液，置于干净灭菌的EP管中；EP管中加入超纯水稀释吸取的汁液样品；稀释汁液即可作为待检测液，用于RT-PCR检测反应。(2)取一定量待检测液，加入NTPs、5XM-MLV缓冲液、反向引物、M-MLV ReverseTranscriptase、RNasin> ddH20 等进行反转录；(3)以反转录产物为DNA模板，加入正向引物、反向引物、2XTaq PCRMasterMix,ddH20进行PCR扩增，所述正向引物，反向引物分别标记了地高辛、荧光素；(4)采用常规方法制备胶体金溶液、胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体结合物、层析试纸条，在检测点加入荧光素单克隆抗体，在质控点加入羊抗兔多克隆抗体；(5)将步骤(3)中所得PCR产物与胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体结合物混合后插入试纸条，如果检测点和质控点均显色则为锦紫苏类病毒阳性结果，仅质控点显色则为阴性结果；所述的锦紫苏类病毒为，CbVd-1、CbVd-2、CbVd-3、CbVd-4、CbVd-5、CbVd-6。所述的通用引物为:正向引物(F-primer)序列为5’ -CTGCAACGGAATYCAGKGC-3’，反向引物(R-primer)序列为5’ -CGCTGCCAGGGAACCCAGGT-3’ ；正向引物的5 ’端标记地高辛，反向引物的5 ’端标记荧光素。所述的胶体金溶液的制备法如下:(I)取1%氯金酸0.6mL，加30mL超纯水加热煮沸；(2)加37°C预热的I %柠檬酸钠溶液0.9mL，快速一次加入，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸3-5min,补水至总体积31.5mL。(3)冷却后，用 0.2mol / L K2CO3 调 pH 至 8.0-9.0，用 0.45 μ m 滤膜过滤，4°C保存。所述胶体金-兔抗地高辛多克隆抗体结合物的制备方法如下:(I)取纯化好的兔抗地高辛多克隆抗体300 μ g，在磁力搅拌下缓慢加入胶体金液18mL,室温搅拌30min ；(2)加入10 %牛血清白蛋白lmL，室温搅拌5min ；(3)加入10%聚乙二醇0.4mL，室温本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种锦紫苏类病毒快速检测方法，其特征在于：包括锦紫苏类病毒RNA的提取、RT‑PCR反应和PCR产物的核酸胶体金层析试纸条检测步骤，具体如下： (1)用移液枪从新鲜的锦紫苏植物茎干或者叶片中吸取汁液，置于干净灭菌EP管中；在EP管中加入超纯水稀释吸取的汁液样品； (2)取一定量稀释后的汁液，并加入NTPs、5×M‑MLV缓冲液、R‑primer、M‑MLV逆转录酶、RNasin、ddH2O等进行反转录； (3)以反转录产物为模板，加入待测锦紫苏类病毒的通用引物反向引物R‑primer、正向引物F‑primer、2×Taq PCR MasterMix、ddH2O进行PCR扩增，所述正向引物，反向引物分别标记了地高辛、荧光素； (4)采用常规方法制备胶体金溶液、胶体金‑兔抗地高辛多克隆抗体结合物、层析试纸条，在检测点加入荧光素单克隆抗体，在质控点加入羊抗兔多克隆抗体； (5)将步骤(3)中所得PCR产物与胶体金‑兔抗地高辛多克隆抗体结合物混合后插入试纸条，如果检测点和质控点均显色则为锦紫苏类病毒阳性结果，仅质控点显色则为阴性结果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：侯婉莹，姜冬梅，李世访，崔萌萌，许立峰，陈德鑫，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37