【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于烟草抗病性筛选，具体涉及一种鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法及应用。
技术介绍
1、蚜传病毒辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus，chivmv)由辣椒传至烟草，危害迅速上升。chivmv于1979年首次在马来半岛辣椒上被报道，我国于2003年在陕西线辣椒和2006年在海南黄灯笼辣椒上报道了该病毒。chivmv为potyvirus的确定种，自然寄主有辣椒、番茄、烟草、曼陀罗、醉鱼草、藜属植物等，靠蚜虫取食和汁液摩擦传播，在辣椒和烟草间可相互传播。chivmv自2011年首次在云南烟草(云烟85)上被报道后，已蔓延危害至贵州、四川、山东、东北、河南等植烟省，成为烟草生产上最需引起重视的病毒。
2、预防病毒病最有效的措施是种植抗病品种。抗病性评价即是抗病育种中的重要环节；又是病原与寄主互作模式体系中，研究基因沉默/敲除或过表达等材料抗病性和病毒致病性的重要步骤。
3、目前尚无烟草品种对chivmv的抗病性鉴定方法，杨华兵等[1]2014年参考烟草品种抗病性鉴定(gb/t23224-2008)中的tmv和cmv部分，在塑料大棚内通过高压喷枪接种，评价了21个烟草品种对chivmv的抗性：主栽品种k326、nc89、云烟87、红花大金元等均表现感病；且携带va基因抗pvy的烟草品种tn86、tn90、nc55和nc102对chivmv无明显抗性。烟草品种抗病性鉴定(gb/t23224-2008)中的tmv和cmv部分，其抗性评价采用的是感病对照病情指数达到60时，鉴定结果
4、参考文献
5、[1]杨华兵,刘勇,李文正,晏孝雨,李永平.烟草品种辣椒叶脉斑驳病毒病的症状与抗病性鉴定[j].云南农业大学学报(自然科学),2014,29(01):22-26.
6、[2]刘勇,黄昌军,于海芹.一种选育对辣椒脉斑驳病毒抗性的烟草植物的方法[p].云南省：cn109371056b,2022-04-08.
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法及应用。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法，步骤如下：
4、(1)将待测烟草和感病对照播种育苗，待烟苗长至5～6片真叶时，在烟苗上部展开的叶片上接种含chivmv的接种液；接种后，喷洒清水洗去残留液，25～27℃培养；
5、(2)接种后7～10天观察系统发病率；接种后21天，逐株调查发病级别；
6、(3)根据以下公式计算发病率、病情指数；
7、
8、
9、(4)当感病对照21天发病率达100％且病情指数di0≧60时，采用病情指数di评价待测烟草品种的抗性，试验结果视为有效，评价标准如下：
10、di＝0为免疫，0<di≦20为抗病，20<di≦40为中抗，40<di≦60为中感，60<di≦80为感病，80<di≦100为高感；
11、当感病对照21天发病率达100％且病情指数40≦di0<60时，根据式(三)计算抗性指数ri，采用抗性指数评价待测烟草品种抗性，试验结果视为有效，评价标准如下
12、ri<-2为抗病，-2≦ri<-1为中抗，-1≦ri<-0.5为中感，-0.5≦ri<0为感病，0≦ri为高感；
13、
14、当感病对照21天发病率未达100％或发病率达100％但病情指数di0<40时，试验结果仅做辅助参考。
15、在一个具体的实施例中，所述步骤(1)接种液中chivmv的浓度为10～20倍质量浓度。
16、在一个具体的实施例中，所述chivmv由以下方法分离纯化：
17、采集具褪绿黄化‘圆形亮斑’和黄化斑驳的chivmv烟草病叶，pcr扩增病毒cp的特异性片段和基因组全长，比对分离物株系；在8叶期以下的cv91、三生nn或k326、nc89上汁液摩擦接种，9～14d扣取接种叶上的黄化圆单斑，研磨成病汁液二次接种纯化；将单斑汁液接种于繁殖寄主5～6叶期本氏烟上，7～10d上部叶出现黄化斑驳和皱缩，取显症叶片制备接种物，或-70℃保存备用。
18、在一个具体的实施例中，所述pcr扩增病毒cp的特异性片段的引物序列如下：
19、f1:5’-gccggagagagagtgttga-3’；
20、r1:5’-tattccccgaacgccagcaga-3’。
21、在一个具体的实施例中，所述含chivmv的接种液由以下方法制备而成：
22、取新鲜病叶，在灭菌的研钵中研磨或榨汁机中匀浆后，经纱布过滤，按1g病叶加10～20ml磷酸缓冲液，制备10～20倍质量浓度的接种液。
23、在一个具体的实施例中，所述步骤(1)中烟草播种育苗的方法为：
24、将烟草播种育苗，待烟苗长至3～4片真叶时假植；对材料份数小于100的小样本，假植到直径8cm小花盆内，留有足够生长空间置于一托盘内，每盘10～15株，每品种设置3托盘重复，随机摆放于培养架上；对于材料份数大于100的大样本，假植在16～20孔联体聚乙烯塑料盘内，每品种重复3盘，随机摆放在育苗畦内。
25、在一个具体的实施例中，所述接种含chivmv的接种液的方式为：
26、待烟苗5～6片真叶时，在上部展开叶上匀撒少许600目石英砂；对小样本材料，一手托叶片，另一手采用棉棒蘸取适量接种液，顺叶脉方向轻轻摩擦上部两片展开叶，每蘸取一次接种一株；对大样本材料，采用衣刷蘸取接种液，对育苗畦内烟苗进行顺向和反向摩擦接种，摩擦程度以造成微伤口而不死亡为宜。
27、在一个具体的实施例中，所述步骤(2)中发病级别划分标准如下：
28、chivmv病害严重度级别以株为单位；
29、0级为全株无病；
30、1级为心叶脉明或轻微黄色圆斑，病株无明显矮化；
31、3级为1/3叶片出现褪绿黄斑但不皱缩变形，或病株矮化为正常株高的3/4以上；
32、5级为1/3～1/2出现褪绿黄斑，或少数叶片皱缩变形，或病株矮化为正常株高的2/3～3/4；
33、7级为1/2～2/3出现褪绿黄斑花叶，或皱缩变形或主侧脉坏死，或病株矮化为正常株高的1/2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法，其特征在于，步骤如下：
2.根据权利要求1所述鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)接种液中ChiVMV的浓度为10～20倍质量浓度。
3.根据权利要求2所述鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法，其特征在于，所述ChiVMV有以下方法分离纯化：
4.根据权利要求3所述鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法，其特征在于，所述PCR扩增病毒CP的特异性片段的引物序列如下：
5.根据权利要求4所述鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法，其特征在于，所述含ChiVMV的接种液由以下方法制备而成：
6.根据权利要求1所述鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)中烟草播种育苗的方法为：
7.根据权利要求6所述鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法，其特征在于，所述接种含ChiVMV的接种液的方式为：
8.根据权利要求1所述鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法，其特征在于，所述步骤(2)中发病级别划分标准如下：
9.权利要求1～8任一项所述鉴定烟草抗辣椒脉斑
...【技术特征摘要】
1.一种鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法，其特征在于，步骤如下：
2.根据权利要求1所述鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法，其特征在于，所述步骤(1)接种液中chivmv的浓度为10～20倍质量浓度。
3.根据权利要求2所述鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法，其特征在于，所述chivmv有以下方法分离纯化：
4.根据权利要求3所述鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法，其特征在于，所述pcr扩增病毒cp的特异性片段的引物序列如下：
5.根据权利要求4所述鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：申莉莉，杨金广，焦裕冰，刘艳华，李莹，王英文，江连强，沈广材，刘东阳，郭应成，刘国，张富强，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：
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