本发明专利技术提供一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法及其产物和应用，该制备方法以雷公藤内酯醇为微生物代谢药物，通过特殊诱导子对微生物代谢雷公藤内酯醇，同时得到多种、高产率的基于雷公藤内酯醇的羟基和或甲基化修饰的雷公藤内酯醇衍生物，这些雷公藤内酯醇衍生物具有抑制肿瘤、艾滋病和乙肝病毒的良好作用。本发明专利技术方法绿色环保、选择性强、产率高，能够大规模利用微生物制备雷公藤内酯醇衍生物。
【技术实现步骤摘要】
一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法及其产物和应用
本专利技术涉及一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法及其产物和应用。
技术介绍
卫矛科植物雷公藤（TripterygiumwilfordiiHook.F.），收载于《滇南本草》，其产地主要分布在中国南部，包括浙江、湖南、安徽、云南、福建和台湾等地，其中以福建泰宁产的雷公藤质量为最优（ZhouZL,YangYX,DingJ.etalTriptolide:structuralmodifications,structure–activityrelationships,bioactivities,clinicaldevelopmentandmechanisms,Nat.Prod.Rep.,2012,29,457–475.）。而雷公藤甲素（Triptolide，TP，雷公藤内酯醇）属二萜环氧类化合物，是雷公藤主要的活性成分之一，其在抗癌、抗炎、抗生育、抗血管生成以及免疫抑制等方面表现出了突出的药理活性，其对美国国家癌症研究所(NationalCancerInstitute,NCI)，所列出的全部60种癌细胞均具有良好的抗肿瘤活性，为此，雷公藤甲素在肿瘤和免疫抑制药物开发方面，显示了巨大的应用前景。然而，雷公藤内酯醇在消化系统、血液循环系统以及泌尿生殖系统中严重的毒副作用和极低的水溶性，限制了其研发进程和临床应用。国内外学者成功运用化学法对雷公藤内酯醇进行羟基化和甲基化的修饰改造，其中化学合成法合成的衍生物包括：15、16-羟基雷公藤内酯醇、1β、2β-羟基雷公藤内酯醇（分别由以下专利公开（MichelJ,J,Mahinda,W,Michael,H,etal,Triptolidederivativesusefulinthetreatmentofautoimmunediseases,USPatent1999/6004999,1999-12-21），（Yuan,HW,JohnH,W,Dai,DC,etal,Triptolidelactonederivativesasimmunomodulatorsandanticanceragent,USPatent2010/0331554,2010-12-30.），（Dai,DCandJohnH,W,Triptolidederivativesasimmunomodulatorsandanticanceragents,PCTWO2004/058246A1,2004-07-15.））;5α-羟基雷公藤内酯醇（由以下文献公开：LLDT-8;（Li,YC,ZouJP,ZhangF,Triptolidederivativesandtheiruses,USPatentUS2009/7626044B2,2009-12-01.）,（李援朝，左建平，张凡，周茹，丁健。雷公藤内酯醇衍生物及其应用。中国专利，ZL03102976.02003-01-23）），5α，6α、5β，6β–双羟基雷公藤内酯醇（分别由以下专利公开：（Li,YC,ZouJP,ZhangF,Triptolidederivativesandtheiruses,USPatentUS2009/7626044B2,2009-12-01.），（Dai,DCandJohnH,W,Yuan,HW,Triptolide5,6derivativesasimmunomodulatorsandanticanceragentsandtheiruses,USPatentUS2010/7820834B2,2010-10-26.））；19-甲基雷公藤内酯醇（由以下专利公开：.H.袁，J.H.马瑟,D.戴。用作免疫调节药和抗癌药的雷公藤内酯醇环衍生物，中国专利号，200580006875.1,2005-03-02.），修饰后的产物提高了水溶性，其中LLDT-8正在中国进行治疗关节炎的临床一期实验。虽然化学修饰为大规模制备雷公藤内酯醇相关衍生物提供了广阔的前景，但是但化学合成法存在得率低、选择性差、副产品多、过程较繁杂等缺点，具有一定的局限性。而在另一方面，利用具有仿生代谢能力的微生物直接通过微生物特殊的酶促作用直接转化生物雷公藤内酯醇产生多种体内代谢、减毒后的雷公藤内酯醇的衍生物也取得了一定的效果，例如，Ning等用短刺小克银汉霉（Cunninghamellablakesleeana）生物转化雷公藤甲素，可以同时得到1β、2β、5α、15、16、19α、19β位羟基化7种羟基化产物，而且各种产物抑制肿瘤的活性显著，其毒性均小于雷公藤甲素，通过比较也不难发现虽然小克银汉霉菌属对雷公藤类化合物的转化虽然比较完全，但其转化率都较低，其中转化率最大的代谢产物5α-羟基雷公藤甲素也只有18%。因此，需要利用生物工程技术优化和完善该技术，进而提高转化产物的产率，以此得到更多的雷公藤内酯醇衍生物。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一，在于提供一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，该方法绿色环保、选择性强、产率高，能够大规模利用微生物制备雷公藤内酯醇衍生物。本专利技术是这样实现的上述技术问题之一的：一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，包括以下步骤：步骤一：取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支，置于25℃恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至107～108个/mL，既得种子孢子液；步骤二：以100ml，5mL的接种量，在土豆液体培养基上接种步骤一所得孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.1～4ug的接种量，加入各种不同比例的联合诱导子，继续培养12h后，再按1～10ug的接种量加入雷公藤内酯醇，然后继续培养5天，每天检测各种雷公藤内酯醇衍生物的含量和转化率，当产物转化率低至0.5～3%时，停止培养，过滤后收集菌丝体，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液；步骤三：将步骤二所得提取液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌丝体则用重量比为1：3～1：10的乙酸乙酯超声提取30min，然后滤去菌丝体，所得滤液与萃取液合并，既得分离提取液，提取液浓缩至干，得到提取后残渣；步骤四：将经过步骤三处理所得的残渣，用1mg：1～10mL的比例用丙酮溶解后，采用硅胶拌样后挥干，称取20倍于样品量的硅胶，使用湿法进行填柱和上样；首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次用体积比为：10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯洗脱液，依次对柱子进行洗脱，最后用100%乙酸乙酯再洗脱柱子，TLC控制收集主馏分，最后使用旋转蒸发仪将各个馏分的流动相蒸干后，用适量色谱纯的甲醇溶解后，用0.22μm的有机膜过滤后，得到分离液；步骤五：将经过步骤四处理所得的分离液，采用高效液相半制备法分离纯化，HPLC梯度洗脱法控制收集不同的雷公藤内酯醇衍生物洗脱液，减压蒸去溶剂后，用甲醇结晶后所得到的化合物，即为所述的雷公藤内酯醇衍生物。进一步地，所述的土豆培养基为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L；配置时将土豆去皮后将其切成本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支，置于25℃恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至107～108个/mL，既得种子孢子液；步骤二：以100ml，5mL的接种量，在土豆液体培养基上接种步骤一所得孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.1～4ug的接种量，加入各种不同比例的联合诱导子，继续培养12h后，再按1～10ug的接种量加入雷公藤内酯醇，然后继续培养5天，每天检测各种雷公藤内酯醇衍生物的含量和转化率，当产物转化率低至0.5～3%时，停止培养，过滤后收集菌丝体，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液；步骤三：将步骤二所得提取液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌丝体则用重量比为1：3～1：10的乙酸乙酯超声提取30min，然后滤去菌丝体，所得滤液与萃取液合并，既得分离提取液，提取液浓缩至干，得到提取后残渣；步骤四：将经过步骤三处理所得的残渣，用1mg：1～10mL的比例用丙酮溶解后，采用硅胶拌样后挥干，称取20倍于样品量的硅胶，使用湿法进行填柱和上样；首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次用体积比为：10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯洗脱液，依次对柱子进行洗脱，最后用100%乙酸乙酯再洗脱柱子，TLC控制收集主馏分，最后使用旋转蒸发仪将各个馏分的流动相蒸干后，用适量色谱纯的甲醇溶解后，用0.22μm的有机膜过滤后，得到分离液；步骤五：将经过步骤四处理所得的分离液，采用高效液相半制备法分离纯化，HPLC梯度洗脱法控制收集不同的雷公藤内酯醇衍生物洗脱液，减压蒸去溶剂后，用甲醇结晶后所得到的化合物，即为所述的雷公藤内酯醇衍生 物。...
【技术特征摘要】
1.一种雷公藤内酯醇衍生物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支，置于25℃恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至107～108个/mL，即得种子孢子液；步骤二：以100ml土豆液体培养基中接种5mL的接种量，在土豆液体培养基上接种步骤一所得孢子液，在pH值6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.1～4ug的接种量，加入各种不同比例的联合诱导子，继续培养12h后，再按1～10ug的接种量加入雷公藤内酯醇，然后继续培养5天，每天检测各种雷公藤内酯醇衍生物的含量和转化率，当产物转化率低至0.5～3％时，停止培养，过滤后收集菌丝体，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液；步骤三：将步骤二所得提取液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌丝体则用重量比为1：3～1：10的乙酸乙酯超声提取30min，然后滤去菌丝体，所得滤液与萃取液合并，即得分离提取液，提取液浓缩至干，得到提取后残渣；步骤四：将经过步骤三处理所得的残渣，用1mg：1～10mL的比例用丙酮溶解后，采用硅胶拌样后挥干，称取20倍于样品量的硅胶，使用湿法进行填柱和上样；首先用5倍柱体积的100％石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次用体积比为：10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯洗脱液，依次对柱子进行洗脱，最后用100％乙酸乙酯再洗脱柱子，TLC控制收集主馏分，最后使用旋转蒸发仪将各个馏分的流动相蒸干后，用适量色谱纯的甲醇溶解后，用0.22μm的有机膜过滤后，得到分离液；步骤五：将经过步骤四处理所得的分离液，采用高效液相半制备法分离纯化，HPLC梯度洗脱法控制收集不同的雷公藤内酯醇衍生物洗脱液，减压蒸去溶剂后，用甲醇结晶后所得到的化合物，即为所述的雷公藤内酯醇衍生物；所述方法可用于制备的雷公藤内酯醇衍生物如下：16-羟基雷公藤内酯醇、15-羟基雷公藤内酯醇、2β-羟基雷公藤内酯醇、1β-羟基雷公藤内酯醇、5α-羟基雷公藤内酯醇、19α-羟基雷公藤内酯醇、19β-羟基雷公藤内酯醇、5α-羟基-14表雷公藤甲...
【专利技术属性】
技术研发人员：张景红，谢深霞，唐圆圆，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：
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