【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及禽类感染病毒检测
,具体是指。
技术介绍
新城疫(Newcastledisease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle diseasevirus, NDV)引起的禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和病死率,是危害养禽业的一种主要传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类疫病。目前新城疫病毒的监测方法包括传统方法与分子生物学方法。传统方法如病毒分离培养和血清学诊断等,其不足之处在于操作繁琐、诊断时间长等,而分子生物学方法如RT-PCR等具有特异、敏感、简便快捷等特点,克服了传统方法的局限性,但不能进行高通量检测,这样不能满足海关的出入境检疫要求。因此,需要专利技术一种新的新城疫病毒的检测方法以解决上述技术问题。液相芯片检测技术是一个全新的快速高通量检测技术,该技术集流式细胞技术、荧光编码微球、激光、数字信号处理和传统的生化技术于一体,具有独特的优点:通过高通量手段可降低成本和劳动力;检测样本量需求少,可通过液相荧光编码微球芯片的方法,在自然的液相反应条件下缩短检测时间;相对于固相平板芯片,液相反应动力学反应更快速、重复性更好;1~100种灵活多重检测,满足多种检测需求:开发平台可适用于多种检测试剂和软件的开发。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有的缺陷,提供一种快速、准确、高通量检测病毒的方法,采用PCR检测方法与液相芯片检测技术结合,建立新城疫液相芯片快速检测方法。本专利技术的技术方案是这样实现的:首先,设计引物 ...
【技术保护点】
一种新城疫病毒的检测方法,其特征在于包括以下步骤:(一)、设计引物及探针:选取现有DNA序列数据库(GENEBANK)中新城疫病毒(NDV)的核蛋白(NP)基因序列进行同源性对比,根据其保守区域,设计出针对各基因片段的引物及探针;(二)、合成及修饰引物和探针:下游引物及探针反向互补序列RC?Probe的5’端标记生物素,得到特异性检测引物,探针Probe的5’?C6标记氨基,得到特异性探针,所述引物和探针序列分别为:引物:ND(NP基因):201bp(198?398)P1:5’?CCTCGTCTCAG?ACAGGGTCAA?3’,P2:5’?CGGCACCTATAAAGCGTTTT?TG?3’,探针及其反向互补序列:Probe:5’?TCCTCTTGGCGATT?CCATCCGC?3’,RC?Probe:5’?GCGG?ATGGAA?TCGCCA?AGAAGA?3’;(三)、特异性探针通过与荧光编码微球进行偶联,制成特异性检测微球(即液相芯片);液相芯片能够特异性识别各基因片段的PCR扩增产物,并通过液相芯片检测仪读出检测结果。
【技术特征摘要】
1.一种新城疫病毒的检测方法,其特征在于包括以下步骤:(一)、设计引物及探针:选取现有DNA序列数据库(GENEBANK)中新城疫病毒(NDV)的核蛋白(NP)基因序列进行同源性对比,根据其保守区域,设计出针对各基因片段的引物及探针;(二)、合成及修饰引物和探针:下游引物及探针反向互补序列RC-PiObe的5’端标记生物素,得到特异性检测引物,探针Probe的5’ -C6标记氨基,得到特异性探针,所述引物和探针序列分别为:引物:ND (NP 基因):201bp (198-398)Pl:5’ -CCTCGTCTCAG ACAGGGTCAA-3’,P2:5’ -CGGCACCTATAAAGCGTTTT TG-3’,探针及其反向互补序列:Probe:5’ -TCCTCTTGGCGATT CCATCCGC-3’,RC-Probe:5’ -GCGG ATGGAA TCGCCA AGAAGA-3’ ;(三)、特异性探针通过与荧 光编码微球进行偶联,制成特异性检测微球(即液相芯片);液相芯片能够特异性识别各基因片段的PCR扩增产物,并通过液相芯片检测仪读出检测结果O2.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的检测方法,其特征在于:设计PCR反应,其中:第一,PCR扩增产物是抽提带有以上新城疫病毒核蛋白(NP)基因的质粒,进行PCR扩增,其反应体系(50μ L)如下:去核糖核酸酶水(RNase-free water ) 34 μ L, 10 X TaKaRa PCR缓冲液 5 μ L,dNTP mix ((10mM/each) 4 μ L,TaKaRa 酶(5U/ μ I) 2 μ L,Pl (20 μ Μ) I μ L,质粒 DNA模板2 μ L,P2 (20 μ Μ) 2 μ L ;反应条件设定为:95°C热启动3分钟;94°C变性30秒,52°C褪火I分30秒,72 °C延伸I分钟。3.根据权利要求1所述的一种新城疫病毒的检测方法,其特征在于:所述特异性探针通过与荧光编码...
【专利技术属性】
技术研发人员:詹爱军,周建忠,
申请(专利权)人:江苏博爱生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:
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